UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTÓBAL DE HUAMANGA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA “Validación de un método analítico por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para la cuantificación de Levotiroxina sódica en Presentado por: Bach. Michel Sicha Gutierrez Asesor: Mg. Maricela López Sierralta 2024 tabletas, Lima - 2022” Ayacucho - Perú Tesis para optar el Título Profesional de: Químico Farmacéutico iii A mis padres Florabel y Plácido, hermanos Gabriel y Mabel, mi segunda madre Juanita. Por el apoyo incondicional. v AGRADECIMIENTOS Me gustaría expresar mi gratitud a la Universidad Nacional San Cristóbal de Huamanga, centro de conocimiento, por haberme recibido en sus instalaciones. Quiero reconocer especialmente a la Facultad de Ciencias de la Salud, en particular, a la Escuela Profesional de Farmacia y Bioquímica. Agradezco a su distinguido cuerpo docente por su noble labor, ya que me han brindado conocimientos esenciales que han ayudado a mi crecimiento profesional. Asimismo, quiero agradecer a la Mg. Maricela López Sierralta y al Q.F Jorge Trujillo Azahuanche por brindar su amplia experiencia, conocimientos y asesoría durante el proceso de realización de este trabajo de investigación. No puedo dejar de mencionar al Dr. Luis Kanashiro Chinen, a la Dra. Elisa Zavala Fernández, al Mg. Deivy Quiroz Delgado y al Q.F Juan Obregón Pillaca, quienes han brindado su apoyo moral y técnico, siendo piezas clave en mi crecimiento personal y profesional. Además, quiero expresar mi gratitud a mis compañeros del departamento de I+D por su constante apoyo y colaboración. vii ÍNDICE GENERAL Página ÍNDICE DE TABLAS ix ÍNDICE DE FIGURAS xi ÍNDICE DE ANEXOS xiii RESUMEN xv I. INTRODUCCIÓN 1 II. MARCO TEÓRICO 3 2.1. Antecedentes del estudio 3 2.2. Marco conceptual 8 2.2.1. Validación 8 2.2.2. Parámetros de validación 8 2.2.3. Tipos de procedimientos analíticos a validar 10 2.2.4. Cromatografía líquida de alto rendimiento 12 2.2.5. Levotiroxina sódica 14 2.2.6. Medicamento 16 III. MATERIALES Y MÉTODOS 17 3.1. Lugar de ejecución 17 3.2. Población y muestra 17 3.3. Metodología y recolección de datos 17 3.3.1. Tipo de investigación 17 3.3.2. Desarrollo del método analítico 17 3.3.3. Determinación de parámetros de validación 19 3.3.4. cálculos 25 3.3.5. Análisis de datos 29 IV. RESULTADOS 31 V. DISCUSIÓN 41 VI. CONCLUSIONES 45 VII. RECOMENDACIONES 47 VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 49 ANEXOS 53 ix ÍNDICE DE TABLAS Página Tabla 1 Parámetros de validación según el Consejo Internacional para la Armonización de Requisitos Técnicos para Productos Farmacéuticos de Uso Humano (ICH). 11 Tabla 2 Información necesaria para la validación según la farmacopea de los Estados Unidos de América. 12 Tabla 3 Pureza de pico cromatográfico en muestras que contienen levotiroxina sódica al evaluar la especificidad. Lima-2022. 33 Tabla 4 Porcentaje de recuperación de analito, en la evaluación de la especificidad-interferencia con el pico de analito. Lima- 2022. 34 Tabla 5 Pureza de pico cromatográfico en muestras que contienen levotiroxina sódica, sometidas a degradación forzada. Lima- 2022. 35 Tabla 6 Porcentaje de recuperación del analito (levotiroxina sódica) en presencia de placebo. Para la evaluación de la exactitud. Lima – 2022. 38 Tabla 7 Desviación estándar relativa, del porcentaje obtenido de levotiroxina sódica, entre analista 1 y analista 2, para la evaluación de la repetibilidad y precisión intermedia en tabletas que contienen levotiroxina sódica.. Lima – 2022. 39 xi ÍNDICE DE FIGURAS Página Figura 1 Estructura química de levotiroxina sódica. 15 Figura 2 Curva de calibración de concentración versus área, para la evaluación de la linealidad del sistema, del método analítico. Lima-2022. 36 Figura 3 Curva de calibración de concentración versus área, para la evaluación de la linealidad del método analítico y exactitud. Lima-2022. 37 xiii ÍNDICE DE ANEXOS Página Anexo 1 Desviación estándar de tiempos de retención y áreas en la evaluación de la precisión instrumental de inyecciones repetidas de una muestra de levotiroxina sódica. Lima- 2022. 55 Anexo 2 Especificidad - Interferencias. Resultado de pureza de pico de analito (levotiroxina sódica). Lima-2022. 56 Anexo 3 Especificidad - Interferencias. Resultado de pureza de pico de analito (levotiroxina sódica) en presencia de placebo. Lima-2022. 57 Anexo 4 Espectro tridimensional de estándar de Levotiroxina sódica. Lima-2022. 58 Anexo 5 Espectro tridimensional de muestra (Levotiroxina sódica tableta). Lima-2022. 59 Anexo 6 Identificación. Comparación de muestra que contiene el analito con base de datos (espectros) de diferentes estándares de referencia. Lima-2022. 60 Anexo 7 Estadísticas de curva de calibración de concentración versus área, para la evaluación de la linealidad del sistema, del método analítico. Lima-2022. 61 Anexo 8 Estadísticas de curva de calibración de concentración versus área, para la evaluación de la linealidad del método analítico y exactitud. Lima – 2022. 62 Anexo 9 Resumen de datos y resultados de linealidad de sistema. Lima-2022. 63 Anexo 10 Residuales, concentración versus residuos, para la evaluación de la aleatoriedad de los resultados en la prueba de linealidad de sistema. Lima- 2022. 64 Anexo 11 Resumen de datos y resultados de linealidad de método. Lima-2022. 65 Anexo 12 Residuales, concentración versus residuos, para la evaluación de la aleatoriedad de los resultados en la prueba de linealidad de método. Lima-2022. 66 Anexo 13 Resultados y evaluación estadística de la linealidad. Lima-2022. 67 Anexo 14 Matriz de consistencia 68 xv RESUMEN A través de la validación se obtienen pruebas documentadas que demuestran que un método es confiable y reproducible. En el presente estudio, el objetivo fue validar un método analítico utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para cuantificar levotiroxina sódica en tabletas. La investigación se llevó a cabo en el laboratorio farmacéutico Medifarma SA, ubicado en la ciudad de Lima. Se realizó una evaluación descriptiva simple. Las condiciones cromatográficas del método evaluado fueron, la columna cromatográfica de relleno L1 (Hypersil DBS C18), 250 mm x 4,6 mm x 5 µm; la velocidad de flujo socrático de 1,0 mL/min; la temperatura del horno de columna a 25 ºC y el volumen de inyección de 20 µL. El análisis y evaluación de algunos parámetros de validación garantiza la especificidad adecuada del método, con purezas de pico superiores a 999,5. Además, se obtuvo una linealidad con un coeficiente de determinación (r2) de 0,9997 y 0,9996 para la linealidad del sistema y del método, respectivamente. El método analítico demostró exactitud en el rango de trabajo del 70 % al 130 %, con una recuperación del analito (levotiroxina sódica) del 99,58 %. Con una repetibilidad de 0,22 % y precisión intermedia de 0,00 %. El conjunto de resultados alcanzados nos permite decir que el método analito validado para la cuantificación de levotiroxina sódica en tabletas es confiable. En conclusión, se validó el método analítico utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para cuantificar levotiroxina sódica en tabletas, el cual cumple los parámetros de especificidad, linealidad, intervalo, exactitud y precisión. Palabras clave: Levotiroxina sódica, validación, método analítico. 1 I. INTRODUCCIÓN La industria farmacéutica, como parte del cumplimiento de las normativas Internacionales BPL y BPM, recurre a la validación de métodos analíticos, con el cual se busca demostrar que los métodos analíticos son adecuados para su propósito. Para ello se realizan una serie de pruebas denominadas parámetros de validación, a los cuales se someterán los métodos analíticos a validar.1 Un método analítico validado, es usado como alternativa a las monografías farmacopeicas. Los organismos regulatorios como The United States Pharmacopeia (USP), Food and Drug Administration (FDA) y International Conference on Harmonisation (ICH), exigen la realización de estudios de validación, para el cumplimiento, como requisito imprescindible de la Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL).2 En la industria farmacéutica se busca que los métodos analíticos sean lo más confiable posible, para lo cual se utilizan técnicas como la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), que se caracteriza por la eficiencia en la separación y cuantificación de analitos por medio de la detección e identificación de picos cromatográficos. La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) ofrece numerosas ventajas en comparación con los métodos analíticos tradicionales. Esta técnica permite realizar análisis con tiempos rápidos, logrando la separación y diferenciación de componentes de una muestra en combinaciones complejas con alta resolución. Además, el HPLC facilita la ejecución de análisis con exactitud y facilidad. Una de las ventajas más destacadas de esta tecnología es su sistema automatizado. Mediante el uso de un sistema HPLC automatizado, se puede inyectar la muestra, llevar a cabo la separación cromatográfica, identificar y cuantificar cada sustancia encontrada en la muestra, y finalmente repetir el ciclo con otra muestra.3 2 La glándula tiroidea produce dos hormonas relacionadas, la tiroxina (T4) y la triyodotironina (T3), estas hormonas desempeñan funciones muy importantes desde el desarrollo fetal, hasta la conservación del homeostasis termogénica y metabólica en el adulto.4 El uso de hormonas sintéticas como la Levotiroxina sódica vienen siendo utilizadas para el tratamiento de diversas enfermedades relacionadas con la deficiencia de las hormonas tiroideas. La importancia de un método analítico confiable para la industria farmacéutica, permite que los medicamentos evaluados en las diferentes áreas de control, sean seguros y eficaces para el propósito por el cual fueron indicados.3 El método analítico validado permitirá el control cuantitativo rápido, seguro y eficaz de los productos farmacéuticos que contengan Levotiroxina sódica tabletas. Contribuyendo al crecimiento tecnológico y científico de los sectores donde se requieran. Los objetivos planteados fueron los siguientes: Objetivos generales Validar un método analítico por cromatografía liquida de alto rendimiento (HPLC) para la cuantificación de Levotiroxina sódica en tabletas y documentar los resultados obtenidos. Objetivos específicos • Determinar la especificidad del método analítico. • Determinar la linealidad del sistema, linealidad del método y el intervalo del método analítico. • Determinar la exactitud, repetibilidad y precisión intermedia del método analítico. 3 II. MARCO TEÓRICO 2.1. Antecedentes del estudio Arévalo5, realizó un trabajo de investigación donde desarrolló y validó un método analítico para determinar ácidos grasos como el oleico, palmítico y esteárico por HPLC en diferentes aceites vegetales”, este trabajo fue presentado en Ecuador, en el año 2021. El objetivo fue determinar los parámetros de validación establecidos por la ICH. Se establecieron las condiciones experimentales para la cromatografía utilizando estándares de los ácidos grasos mencionados. El sistema cromatográfico fue desarrollado y adecuado para el buen rendimiento analítico. Posteriormente, se procedió al procesamiento de adecuación de la muestra, que consistió en la hidrólisis de la misma. Los ácidos grasos libres resultantes se reconstituyeron utilizando hexano, el cual fue posteriormente evaporado y nuevamente reconstituido con metanol para su análisis mediante HPLC. En la validación, se logró una recuperación de analito de 100,3 % en promedio. La linealidad del método presentó un coeficiente de determinación (r2) superior a 0,98. Además, se determinó que la incertidumbre fue del 4,76 % para el ácido oleico, 8,08 % para el ácido palmítico y 1,62 % para el ácido esteárico. Cada ácido graso fue validado de forma independiente y los tres cumplieron con todos los parámetros establecidos en el protocolo de validación. Mustafá et al.6, Publicaron un trabajo de investigación titulado “Determinación simultánea de amoxicilina, lansoprazol y levofloxacina en productos farmacéuticos mediante HPLC con detector UV-Vis”, en el país de China, en el año 2020. La investigación se enmarcó en la determinación de los parámetros de validación establecidos por la ICH. En la investigación realizada se utilizó como técnica la cromatografía líquida de alto rendimiento, así como un detector UV-Vis con arreglo de diodos, se realizaron algunos ensayos que forman parte de los parámetros de validación. Se obtuvieron excelentes correlaciones de calibración (r2: 0,9942, 4 0,9997 y 0,9974) para amoxicilina, lansoprazol y levofloxacina respectivamente. Los porcentajes de recuperación de amoxicilina, lansoprazol y levofloxacina en productos farmacéuticos comerciales se obtuvieron como 105,5%, 98,57% y 102,5%, respectivamente. El método de cuantificación fue validado exitosamente, cumpliendo con los parámetros establecidos en el protocolo de validación. Logoyda et al.7, realizaron un trabajo de científico de investigación, donde se desarrolló y validó por método HPLC, la determinación simultanea de maleato de enalapril en presencia de sus impurezas con aplicación al análisis de tabletas, en el país de Ucrania, en el año 2018. El sistema cromatográfico con flujo isocratico fue desarrollado y adecuado para el buen rendimiento analítico. El método propuesto se validó de acuerdo con las directrices de la ICH con un tiempo de ejecución total inferior a 9 minutos. El coeficiente de correlación (r2) fue de 0,99981 que indica que el método fue lineal a la concentración frente a las respuestas del área del pico cromatográfico. En conclusión, el método analítico fue validado exitosamente, cumpliendo con las directrices de la ICH, el método desarrollado y validado fue utilizado para la determinación del maleato de enalapril en presencia de sus impurezas en forma de tableta. Choque8, publicó un trabajo en el que desarrolló y validó un método analítico que indica la estabilidad del ácido acetil salicílico en tabletas por método de cromatografía HPLC, Bolivia año 2017. El método analítico que indica la estabilidad del analito, las condiciones cromatográficas se establecieron para una fase reversa isocrática, con presencia de solvente orgánico y solución tampón para la fase móvil. El resultado mostró una resolución entre picos de 7,41 entre picos cercanos y un coeficiente de variación entre inyecciones de ± 0,96%. Se sometió a diferentes tipos de degradación forzada como la termólisis en estufa, oxidación, fotólisis en cámara acondicionada e hidrólisis ácida y alcalina. Se determinó que las soluciones fueron más estables frente a la fotólisis y la hidrólisis ácida. Además, se evaluó la robustez de la muestra para su análisis en diferentes intervalos de tiempo, y se encontró que la muestra se mantuvo estable hasta los 120 minutos. El método fue validado utilizando parámetros de validación establecidos en las directrices de la ICH y farmacopeas de referencia. Jitendra et al.9, trabajaron en la investigación titulada “Desarrollo y validación de un nuevo método RP-HPLC de dapagliflozina en Forma de dosificación a granel y en tabletas”, India año 2017. Para lo cual se utilizaron los criterios de validación establecido por la ICH, la técnica elegida fue RP-HPLC. El sistema cromatográfico 5 fue de fase reversa isocrático, para la detección se utilizó un detector DAD. Se encontró que el tiempo de retención de dapagliflozina era de 3,461 minutos. La validación del método desarrollado se realizó según la USP y Directrices de la ICH. La validación del método reveló que el método es rápido, exacto, preciso, confiable y reproducible. Los gráficos de calibración lineal fueron obtenidos en el rango de concentración de 10-60 μg/mL para Dapagliflozin. El límite de detección fue de 0,02 µg/mL y el límite de cuantificación fue de 0,06 µg/mL para Dapagliflozin. La alta recuperación y los bajos coeficientes de variación confirman la eficacia del proceso en la forma farmacéutica. Los parámetros de validación fueron realizados exitosamente indicando que el método es válido y puede ser utilizado con éxito para el análisis cuantitativo de tabletas disponibles comercialmente. Hurtado10, llevó a cabo un estudio de investigación titulado "Desarrollo y validación de una metodología analítica para la determinación de diez residuos de antibióticos veterinarios en Oncorhynchus mykiss" en el año 2021, en la Universidad Peruana Cayetano Heredia. En esta investigación, se vio por conveniente el uso de la cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada a un detector de ICP-masas de triple cuadrupolo. El objetivo fue validar el método analítico de acuerdo a los criterios de aceptabilidad descritos en la guía de validación de métodos químicos del Programa de Alimentos y Medicina Veterinaria de la Administración de Alimentos y Drogas de los Estados Unidos (FDA). Los parámetros evaluados incluyeron la selectividad, linealidad (con valores de r ≥ 0,997 y r2 ≥ 0,994), sensibilidad, el límite de detección (con valores ≤ 1,994 µg/Kg), límite de cuantificación (con valores ≤ 6,647 µg/Kg), la recuperación (entre 90% y 118%), precisión (menor al 6%), precisión intermedia (menor al 9%) y el rango mínimo de trabajo (desde 5,6 µg/Kg hasta 14,4 µg/Kg). El resultado de la validación del método fue exitoso, lo que indica que se cumplió con los criterios establecidos en la guía de validación del Programa de Alimentos y Medicina Veterinaria de la FDA. Bocanegra11, publicó el trabajo de investigación científica sobre la validación de un método por cromatografía líquida de alta resolución con el objetivo de determinar cinco vitaminas hidrosolubles en solución endovenosa inyectable, en la Universidad Nacional de Trujillo año 2021. El objetivo de la investigación fue evaluar diferentes parámetros de validación para la cuantificación de cinco vitaminas hidrosolubles, las vitaminas analizadas fueron: riboflavina 5-fosfato 6 sódica, ácido ascórbico, pantenol, piridoxina clorhidrato y nicotinamida. Para lograrlo, se implementó un sistema de cromatografía liquida en gradiente que utilizó metanol como fase móvil y una solución buffer de hexanosulfonato sódico a pH 2,7, se empleó una columna L1. La detección se realizó mediante un arreglo de diodos. Además, se utilizaron solventes orgánicos y soluciones tampón como fase móvil y diluyente. Los resultados obtenidos fueron favorables en términos de precisión instrumental, ya que tanto el área como el tiempo de retención presentaron una R.S.D. (Desviación Estándar Relativa) menor o igual al 2,0%. La metodología analítica demostró ser específica, con purezas de pico de no menos de 0,99, la degradación oxidativa del ácido ascórbico mostró una pureza de pico de entre 0,75 a 0,79. Se demostró linealidad y exactitud, recuperando entre el 98,0 % y el 102,0 % de las concentraciones propuestas. Además, la precisión intramétodo e intralaboratorio también obtuvo valores de R.S.D. inferiores al 2,0%. En conclusión, los parámetros de validación establecidos, cumplieron con las especificaciones dadas para los analitos sometidos a prueba: riboflavina 5-fosfato sódica, ácido ascórbico, pantenol, piridoxina clorhidrato y nicotinamida. Por lo tanto, se determinó que la metodología analítica es adecuada para su uso bajo las condiciones propuestas. Bardales et al.12, llevaron a cabo una investigación titulada "Validación de una metodología por cromatografía líquida de alta resolución para la valoración de cloruro de benzalconio en Gentamicina 0,3% solución oftálmica" en la Universidad Nacional de Trujillo en el año 2021. El propósito principal de esta investigación fue evaluar diversos parámetros de validación para asegurar la fiabilidad del método analítico utilizado. Para lograr esto, se empleó un método de cromatografía líquida de alta resolución. Los parámetros evaluados incluyeron la especificidad, linealidad, exactitud, precisión, robustez y rango. Los resultados obtenidos mostraron que la metodología fue exitosa en cada uno de estos aspectos: El método fue específico, ya que no hubo interferencias significativas por parte de excipientes o productos de degradación que pudieran afectar el análisis del cloruro de benzalconio, el analito de interés. Se demostró que la relación entre la concentración del analito y la respuesta del detector fue lineal, r = 0,9998 como valor de coeficiente de correlación. Los valores de desviación estándar relativa (DRS) se mantuvieron por debajo del 2 %, cumpliendo con los criterios de precisión establecidos. Se obtuvo una recuperación promedio del 99,88 %, lo que indica que los resultados obtenidos se acercaron al valor verdadero o teórico. El 7 método fue considerado robusto, ya que cumplió con los criterios de aceptación establecidos para el coeficiente de variación, presentando una variación dentro del 2 % aceptable y dentro del intervalo establecido. En conclusión, la metodología analítica demostró cumplir con los parámetros de especificidad, linealidad, exactitud, precisión y robustez para la cuantificación de cloruro de benzalconio en el colirio de Gentamicina al 0,3 %. Esto asegura la confiabilidad y aplicabilidad del método analítico en la determinación de la cantidad de cloruro de benzalconio en dicha solución. Fabian13, publicó el trabajo de investigación titulado “Validación del método analítico por cromatografía líquida de alta resolución para la cuantificación de triprolidina clorhidrato y dextrometorfano bromhidrato en jarabe”, en la Universidad Nacional de Trujillo año 2021. En la investigación se realizó la evaluación de la precisión, exactitud, especificidad y linealidad. El método utilizado para el estudio fue la cromatografía liquida de alta resolución. La investigación demostró que la metodología analítica es altamente selectiva, ya que no se observó interferencia de excipientes o productos degradados en el análisis del principio activo. Además, se evidenció que el método es lineal, ya que los coeficientes de correlación obtenidos fueron 0,99999 para triprolidina clorhidrato y 0,99998 para dextrometorfano bromhidrato, lo cual indica la buena vinculación entre la concentración del analito en muestra y la respuesta del detector. La precisión del sistema e intermedia, expresada como desviación estándar relativa (DSR), arrojó valores inferiores al 2 %. Esto indica una alta precisión en las mediciones, tanto dentro del mismo sistema como entre diferentes análisis. Por otro lado, la exactitud del método se determinó mediante la recuperación, la cual fue del 100,18 % para triprolidina clorhidrato y 100,38 % para dextrometorfano bromhidrato. En conclusión, el método analítico validado en esta investigación es confiable, consistente y adecuado para su uso en los análisis de rutina previstos. Se garantiza la precisión y fiabilidad de los resultados en la cuantificación de triprolidina clorhidrato y dextrometorfano bromhidrato. Choque14, realizó un trabajo de investigación, donde validó una técnica analítica por cromatografía líquida de alta performance (HPLC) para la cuantificación de clorhidrato de clorhexidina + benzocaína + enoxolona en comprimidos orales. Los trabajos fueron realizados en la Universidad Católica de Santa María en el año 2017. La investigación se enmarco en la evaluación de la performance de los procedimientos analíticos para determinar la aptitud del sistema, la exactitud, la 8 especificidad, la exactitud y la precisión del método. También se llevó a cabo una prueba de estabilidad para demostrar la robustez de la muestra. El análisis cromatográfico se realizó mediante la adición del solvente de manera isocrática. El tiempo de retención aproximada para la benzocaína, clorhexidina HCl y enoxolona fue de 2,52 minutos, 3,88 minutos y 9,87 minutos, respectivamente, por esta razón se estableció un tiempo de corrida adecuada, no menor de 15 minutos. Se obtuvieron los siguientes resultados: No se observan interferencias en la especificidad, la interferencia de placebo es de 0,0 % para cada uno de los analitos. El coeficiente de correlación obtenido fue de 0,99937 para benzocaína, 0,99935 clorhexidina HCl y 0,99904 para enoxolona, en la evaluación de la linealidad. Para evaluación de la repetibilidad, se encontró un C.V. de 0,40 % para benzocaína, 1,25 % para clorhexidina HCl y 0,85 % para enoxolona. El porcentaje de recuperación obtenido fue de 99,41 % para benzocaína, 100,42 % para clorhexidina HCl y 99,30 % para enoxolona. Para demostrar la robustez, se realizó la prueba de estabilidad, obteniendo una diferencia de 0,33 para Clorhexidina HCl, 1,49 para benzocaína y 1,68 para enoxolona; los tiempos de análisis fueron de 0, 12 y 24 horas. En conclusión, se demostró que el método es fiable, proporcionando evidencia documentada de su validez y utilidad mediante la evolución de los parámetros de validación. 2.2. Marco conceptual 2.2.1. Validación Es un proceso donde se realizan investigaciones en el laboratorio, que buscan garantizar y comprobar que un método analítico específico producirá resultados consistentes y fiables, apropiados para el propósito deseado. Para lo cual se evalúan diferentes parámetros de validación, la preferencia de los parámetros a evaluar dependerá de la categoría en la cual se ubique según la USP – ICH.15, 16 2.2.2. Parámetros de validación A. Especificidad Se refiere a la condición de poder distinguir de manera clara y precisa el compuesto analizado en medio de otras sustancias de la muestra que se podrían anticipar como presentes. Habitualmente, estos otros componentes podrían comprender impurezas, productos de degradación, matriz, entre otros.15 Estos son los efectos de esta definición: a. Identificación: para garantizar la identidad de un analito. 9 b. Ensayo (contenido o potencia): para proporcionar un resultado exacto que permita una declaración precisa sobre el contenido o la potencia del analito en una muestra. B. Exactitud La exactitud de un método analítico se refleja en qué tan cerca están los resultados de la prueba obtenidos a través del método analítico empleado respecto al valor real. Es esencial determinar la exactitud de un procedimiento analítico en todo el rango de alcance.16 En la evaluación del analito en un producto formulado, se puede determinar la exactitud aplicando el procedimiento analítico a mezclas sintéticas de los componentes presentes en el producto farmacéutico, a las cuales se les agregan cantidades conocidas del analito dentro del rango del procedimiento. Los cálculos de la exactitud se realizan mediante la obtención del porcentaje de recuperación de la cantidad estimada en comparación con la cantidad conocida del analito agregado a la muestra, o también como la diferencia entre la media de la estimación y el valor verdadero aceptado, teniendo en cuenta los intervalos de confianza.16 De acuerdo con las recomendaciones de ICH, se sugiere realizar la evaluación de la exactitud con nueve determinaciones realizadas en al menos tres niveles de concentración diferentes, abarcando el rango especificado. Esto significa que se deben realizar tres mediciones repetidas en cada uno de los tres niveles de concentración para un total de nueve determinaciones. Esta aproximación garantiza una evaluación rigurosa y confiable de la exactitud del procedimiento analítico.16 C. Precisión Se manifiesta como la cercanía en términos de acuerdo (nivel de dispersión) entre una secuencia de mediciones derivadas de múltiples muestras de una misma muestra uniforme en las condiciones especificadas. Los niveles de evaluación a considerar se son: repetibilidad, precisión intermedia y reproducibilidad.15 La evaluación de este parámetro requiere el uso de muestras genuinas y homogéneas. En situaciones donde obtener una muestra homogénea resulta inviable, es factible llevar a cabo investigaciones empleando muestras artificialmente preparadas o soluciones de muestra. Dicha evaluación se suele realizar mediante la medición de varianza, la desviación estándar o el C.V a partir de una sucesión de mediciones repetidas.15 10 a. Repetibilidad: La repetibilidad expresa la precisión del método en las mismas condiciones de trabajo durante el tiempo de corrida. La repetibilidad también se denomina precisión intraensayo. b. Precisión intermedia: La precisión intermedia expresa la variación de resultados dentro del mismo laboratorio: en diferentes días, con diferentes analistas, y en diferentes equipos. D. Linealidad El objetivo de esta evaluación es determinar la capacidad del método analítico, dentro de un rango determinado, para obtener resultados de prueba que son directamente proporcionales a la concentración o cantidad del analito presente en la muestra. Esto nos podrá garantizar una medición precisa y confiable en diferentes niveles de concentración.15 E. Rango Es el intervalo de las concentraciones de la muestra para el que se ha demostrado que el procedimiento analítico tiene un nivel adecuado de precisión, exactitud y linealidad.15 Algunos libros oficiales lo denominan como intervalo. F. Robustez Se refiere a la evaluación de cómo un método analítico puede resistir cambios intencionados y pequeños en los parámetros del procedimiento de análisis, lo que a su vez señala cuán fiable es en condiciones de uso habitual en el laboratorio. Esta evaluación puede llevarse a cabo durante la fase de desarrollo del método analítico.15 2.2.3. Tipos de procedimientos analíticos a validar La evaluación sobre la validación de procedimientos analíticos se centra en los cuatro tipos de pruebas: • Pruebas para la identificación de analitos. 15 • Pruebas para la cuantificación del contenido de impurezas. 15 • Pruebas para la determinación del límite de impurezas. 15 • Pruebas de desempeño como la disolución.15 11 Tabla 1. Parámetros de validación según el Consejo Internacional para la Armonización de Requisitos Técnicos para Productos Farmacéuticos de Uso Humano (ICH). Procedimiento analítico. Identificación de analitos Pruebas de impurezas -Valoración -Disolución Características Cuantificación Límite -Contenido Exactitud - + - + Precisión Repetibilidad - + - + Precisión intermedia - + (1) - + (1) Especificidad (2) + + + + Límite de detección - - (3) + - Límite de cuantificación - + - - Linealidad - + - + Intervalo - + - + - No es necesaria su evaluación. + Se requiere de su avaluación. (1) Si se ha evaluado la reproducibilidad, no será necesario evaluar la precisión. (2) La carencia de especificidad en un método analítico podría ser contrarrestada mediante el respaldo de otros enfoques analíticos. (3) Evaluar la necesidad de su evaluación La farmacopea de los Estados Unidos de América (USP), también establece los parámetros que se deben determinar para la validación de un método analítico, según la categoría en la que las agrupa. Estas son: Categoría I: Métodos de análisis utilizados para cuantificar los componentes fundamentales de medicamentos en estado sin procesar o los ingredientes activos (junto con los agentes conservantes) en productos farmacéuticos terminados. Categoría II: Métodos de análisis destinados a identificar impurezas en medicamentos en estado granel o productos de degradación en medicamentos terminados. Estos procesos incluyen tanto análisis cuantitativos como pruebas de límite. Categoría III: Se lleva a cabo la valoración de las propiedades de desempeño (como la solubilidad y la liberación de fármacos, entre otras). Categoría IV: Se utilizan para validar las técnicas espectroscópicas cualitativas de identificación. Sin embargo, cada una de las diferentes técnicas se puede 12 utilizar para una variedad de propósitos diferentes, y el uso específico de una técnica en particular.16 Tabla 2. Información necesaria para la validación según la farmacopea de los Estados Unidos de América. Características de desempeño analítico Categoría I Categoría II Categoría III Categoría IV Análisis cuantitativo Pruebas de límite Exactitud Si Si a a No Precisión Si Si No Si No Especificidad Si Si Si a Si Límite de detección No No Si a No Límite de cuantificación No Si No a No Linealidad Si Si No a No Intervalo Si Si a a No a Pueden ser necesarios dependiendo de la naturaleza particular de la prueba en cuestión. 2.2.4. Cromatografía líquida de alto rendimiento Gracias a la capacidad para separar elementos de diferente naturaleza presentes en una mezcla, la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) se presenta como una técnica de cromatografía muy utilizada. Se utiliza en una variedad de aplicaciones industriales, incluidas las farmacéuticas, bioquímicas, alimenticias, productos químicos, medicina clínica y química forense. Este método utiliza la fase móvil y la fase estacionaria. La muestra se transporta a través de la fase estacionaria por medio de la fase móvil la cual es líquida. La retención y el proceso de separación de cada uno de los elementos de la mezcla son influenciados por las diferentes fuerzas químicas y físicas que interactúan entre la mezcla analizada y las dos fases. Los elementos que presentan una mayor relación de afinidad hacia la fase estacionaria se moverán con una velocidad menor en comparación con los componentes que tienen una afinidad menor.17 Equipo El equipo cromatográfico HPLC, por lo general trabaja con cinco instrumentos principales: los frascos que contienen la fase móvil, la bomba, el inyector, el horno de columna, el detector y el sistema de toma y procesamiento de datos.17 a. Reservorio de fase móvil Es el recipiente que contiene la fase móvil. Por lo general, se coloca en una posición elevada con respecto al nivel de la bomba para permitir que la gravedad 13 dirija el solvente hacia ella, asegurando así que las conexiones se mantengan llenas. Se puede emplear cualquier recipiente de laboratorio de alta calidad, fabricado en vidrio o polímeros resistentes, junto con una tapa adecuada para prevenir la entrada de partículas del entorno al sistema, como reservorio de la fase móvil. Incluso se puede utilizar los mismos envases donde se comercializan los solventes y de esa manera evitar la contaminación cruzada. Al extremo del tubo de salida de solvente se conecta un filtro con 2 a 10 µm de porosidad que impide el ingreso de partículas a la bomba.18 b. Bomba La fase móvil es impulsada por bombas hacia el inyector y luego hacia la columna desde el reservorio de solvente. Su caudal de trabajo puede variar según sea necesario. Las bombas de pistón, también conocidas como bombas reciprocantes, y las de desplazamiento continuo, también conocidas como bombas de jeringa, son dos tipos de bombas. Las mencionadas en primer lugar son las más comunes porque son adaptables y fáciles de usar en el laboratorio.18 c. Inyector La pieza del equipo que permite inyectar la muestra en la solución sin interrumpir el flujo de solvente a través del sistema se conoce como inyector. El inyector tiene varias características, como: • Debe ser mostrar facilidad para su manipulación • Debe mostrar inercia frente al ataque y desgaste químico. • Debe tener la capacidad de soportar presiones elevadas. • Debe mostrar precisión en la cantidad de muestra que va introducir en el sistema.18 d. Horno de columna El horno se encarga de regular y mantener la temperatura dentro de la columna, ya que esta influye directamente en la retención y selectividad de la misma.17 e. Detector Este elemento del equipo posibilita la "observación" de cada componente de una muestra al salir de la columna cromatográfica. Este elemento debe de cumplir con ciertos requisitos, como: • Contar con una respuesta que abarque un amplio rango dinámico. • Exhibir una respuesta en forma lineal. • No causar el ensanchamiento de la banda fuera de la columna. 14 • Debe dar una respuesta a todos los solutos. • Debe poseer una sensibilidad apropiada. • Permanecer inalterado ante variaciones de temperatura. • Mostrar una relación señal/ruido satisfactorio. los detectores utilizados en cromatografía HPLC pueden ser generales o selectivos. Los detectores generales evalúan el cambio en alguna propiedad física de la fase móvil que contiene el analito en comparación con la fase móvil pura. Ejemplos de detectores generales son el detector de índice de refracción y el detector de conductividad. Por otro lado, los detectores selectivos son sensibles a las características del soluto, como el detector ultravioleta, que emite una señal proporcional a la absorbancia del soluto a una longitud de onda específica.18 Algunos ejemplos de detectores son: • Detector de Índice de refracción • Detector UV • Detector de fluorescencia • Detector electroquímico. f. Sistema de toma y procesamiento de datos Se producen dos resultados a partir del ensayo cromatográfico. Por una parte, se logran divisiones individuales de los constituyentes de la muestra, mientras que, por otra parte, se genera un gráfico cromatográfico que puede analizarse para derivar conclusiones tanto cualitativas como cuantitativas. Un sistema de toma de muestra y procesamiento de datos se utiliza para obtener este registro y posterior manipulación de la señal del detector.18 Forman parte de este sistema: • Registrador gráfico • Integrador • Computadora 2.2.5. Levotiroxina sódica Características Fisicoquímicas El principio activo farmacéutico se presenta como un polvo que tiende a absorber humedad, con un tono amarillo claro a beige, carece de olor y sabor. Es estable en ambientes secos, aunque puede adquirir un matiz ligeramente rosado al estar expuesto a la luz. Se disuelve en soluciones de hidróxidos alcalinos y en soluciones calientes de carbonatos alcalinos. Muestra una baja solubilidad en 15 alcohol, una solubilidad muy limitada en agua, y no es soluble en acetona, cloroformo ni éter.16 3,3′,5,5′- tetrayodotironina Figura 1: Estructura química de levotiroxina sódica. Farmacología La Levotiroxina es una sal sódica del isómero L de tiroxina (tetrayodotironina, T4). Esta molécula es usada para reemplazar una hormona producida normalmente por la glándula tiroides para regular la energía y el metabolismo del cuerpo.19 a. Farmacodinamia La Levotiroxina entra a las células por transporte activo, dentro de la célula la T4 se convierte en T3, ésta última ingresa al núcleo donde se une a una proteína específica del receptor tiroideo T3, lo cual conduce a una mayor formación de RNA y la posterior síntesis de proteínas.20 b. Farmacocinética La absorción ocurre casi exclusivamente en el duodeno, pudiendo alcanzar hasta un 80 %. Si se toma con alimentos, la absorción puede disminuir. A las dos o tres horas después de la digestión alcanza su punto máximo en el plasma. La acción comienza a los 3-5 días después de haber sido ingerido por vía oral. El volumen de distribución oscila entre diez y doce litros. La afinidad de la levotiroxina por proteínas transportadoras específicas es excepcionalmente elevada, cercana al 99,97%. Dado que la unión entre proteína y hormona no es de tipo covalente, la fracción de hormona unida en el plasma experimenta un constante y rápido intercambio con la fracción libre de la hormona. El proceso metabólico de la levotiroxina es de aproximadamente 1,2 litros de plasma por día. Se descompone principalmente en el hígado, el riñón, el cerebro y el músculo. Los metabolitos se eliminan a través de la orina y las heces. La vida 16 útil promedio de la levotiroxina es de siete días, con una disminución en el hipertiroidismo (3 a 4 días) y un aumento en el hipotiroidismo (9 a 10 días).21 2.2.6. Medicamento a. Ingrediente farmacéutico activo: También llamado principio activo, es aquella sustancia química que presenta actividad terapéutica.22 b. Excipientes: Son aquellos componentes del medicamento que no presentan actividad terapéutica. Los excipientes desempeñan una función determinante en la elaboración, conservación, estabilidad y liberación de los principios activos.22 En el análisis de medicamentos, el conjunto de excipientes es llamado placebo o matriz del producto farmacéutico. 17 III. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Lugar de ejecución La investigación tuvo lugar en las instalaciones del laboratorio Farmacéutico Medifarma S.A., situado en el distrito de Ate en el departamento de Lima. 3.2. Población y muestra Población: Grupo de lote piloto de 20 000 tabletas, producido en las instalaciones del laboratorio farmacéutico Medifarma S.A., área de Investigación y Desarrollo. Muestra: 500 tabletas muestreadas de manera aleatoria simple. Estándar de referencia: Levotiroxina sódica Tipo de estándar : secundario Lote : MP00019201 Potencia : 89,6 % T/C Fecha de expira : Septiembre 2023 3.3. Metodología y recolección de datos 3.3.1. Tipo de investigación Descriptivo transversal de nivel básico 3.3.2. Desarrollo del método analítico Fase móvil: Se preparó una mezcla filtrada y desgasificada de Metanol, agua purificada y ácido orto fosfórico en la siguiente proporción (670:330:0.5) respectivamente en mL. 18 Longitud de onda: espectro ultravioleta a 225 nm Columna cromatográfica: L1 (Hypersil DBS C18), 25 cm x 4,6 mm x 5 µm Velocidad de flujo: 1,0 mL/min Temperatura de horno: 25 ºC Volumen de inyección: 20 µL Tiempo de corrida: 15 minutos Tiempo de retención: 11,2 minutos aproximadamente Diluyente: Solución de Hidróxido de sodio 0,01 N.- Se pesó aproximadamente 4,0 g de hidróxido de sodio a un matraz volumétrico de 100 mL, se disolvió con 50 mL de agua purificada y se llevó a volumen con agua purificada. Luego se midió 10 mL de la solución anterior a un matraz volumétrico de 1000 mL, se llevó a volumen con agua purificada. Preparación del estándar Se pesó con exactitud una cantidad equivalente a 25,0 mg de Levotiroxina sódica y se transfirió una fiola de 500 mL, se agregó 200 mL de diluyente y se llevó al baño de ultrasonido por 5 minutos, se dejó atemperar y luego se diluyó hasta alcanzar el volumen de aforo. Se midió 5 mL de la solución anterior a una fiola de 25 mL, Se homogeneizó y filtró por membrana PVDF de tamaño de poro de 0,45µm a un vial ámbar para cromatografía. (Concentración aproximada: 0,01 mg/mL de Levotiroxina sódica). Preparación de la muestra Se tomaron 20 tabletas y se molieron a polvo fino, luego se pesó con exactitud alrededor de 250 mg de polvo (equivalente a 0,25 mg de levotiroxina sódica) y se transfirió a una fiola de 50 mL, se agregaron volumétricamente 25,0 mL de diluyente y se llevó a baño de ultrasonido por 15 minutos con agitación intermitente. Se dejó atemperar las muestras, luego se llevó a centrifugar por 15 minutos a 3500 rpm. Se filtró el sobrenadante por papel filtro de tamaño de poro de 2 a 3 µ, luego se volvió a filtrar por membrana PVDF de tamaño de poro de 0,45 µm a un vial ámbar para cromatografía. (Concentración aproximada: 0,01 mg/mL de Levotiroxina sódica). Cálculos Levotiroxina sódica µg/tab. 19 A M A St x W St 500 x 5 25 x Pot St x 25 W M x PP x 1000 3.3.3. Determinación de parámetros de validación 3.3.2.1 Precisión Instrumental Para medir este valor, se inyectó la solución estándar seis veces seguidas. Se calculó la desviación estándar relativa (RSD) de las áreas y los tiempos de retención. La desviación estándar relativa debe ser del 2 % o menos. 3.3.2.2 Especificidad A. Determinación de posibles interferentes Se analizó diluyente, placebo, analito y analito más placebo, según la técnica analítica propuesta. Examinando las respuestas del análisis en comparación con las de un estándar. La especificidad del método se evaluó al contrastar los resultados del análisis del principio activo tanto con, como sin la presencia del placebo. Los resultados de interferencia deben ser no significativos, presentando no más de 0,5 % de interferencia.24. El valor de pureza de pico se debe de encontrar entre 995 y 1000. Placebo, analito y analito más placebo fueron evaluados por duplicado. Las muestras se inyectaron por duplicado. Placebo: Se realizó una medición precisa de aproximadamente 249,75 mg de placebo en una fiola de 50 mL, se agregaron volumétricamente 25,0 mL de diluyente y se llevó a baño de ultrasonido por 15 minutos con agitación intermitente. Se dejó atemperar las muestras, luego se llevó a centrifugar por 15 Dónde: A M : Área de Levotiroxina sódica en la muestra. A St : Área de Levotiroxina sódica en el estándar. W St : Peso del estándar expresado en mg. Pot St : Potencia del estándar expresado en fracción decimal como tal cual. W M : Peso de la muestra expresado en mg. PP : Peso promedio expresado en mg. 1000 : Factor de conversión de mg a µg. 20 minutos a 3500 rpm. Se filtró el sobrenadante por papel filtro de tamaño de poro de 2 a 3 µ, luego se volvió a filtrar por membrana PVDF de tamaño de poro de 0,45 µm a un vial ámbar para cromatografía. (Concentración aproximada: 0,01 mg/mL de Levotiroxina sódica). Analito: Se pesó con exactitud una cantidad equivalente a 25,0 mg de Levotiroxina sódica, se transfirió a una fiola de 500 mL, luego se agregó 200 mL de diluyente y se llevó al baño de ultrasonido por 5 minutos, se dejó enfriar a temperatura ambiente y se diluyó hasta alcanzar el volumen de aforo. Se midió con exactitud 5,0 mL de la solución anterior y se llevó a una fiola de 50 mL, a ésta fiola se le añadió volumétricamente 20,0 mL de diluyente, se llevó a baño de ultrasonido por 15 minutos con agitación intermitente, luego se centrifugó por 15 minutos a 3500 rpm. Se filtró el sobrenadante por papel filtro de tamaño de poro de 2 a 3 µm, luego se volvió a filtrar por membrana PVDF de tamaño de poro de 0,45 µm a un vial ámbar para cromatografía. (Concentración aproximada: 0,01 mg/mL de Levotiroxina sódica). Analito + Placebo: Se pesó con exactitud una cantidad equivalente a 25,0 mg de Levotiroxina sódica, se transfirió a una fiola de 500 mL, luego se agregó 200 mL de diluyente y se llevó al baño de ultrasonido por 5 minutos, se dejó enfriar a temperatura ambiente y se diluyó hasta alcanzar el volumen de aforo. Se midió con exactitud 5,0 mL de la solución anterior y se llevó a una fiola de 50 mL, se pesó con exactitud alrededor de 249,75 mg de placebo y se agregó a la misma fiola, se añadió volumétricamente 20,0 mL de diluyente, se llevó a baño de ultrasonido por 15 minutos con agitación intermitente, luego se centrifugó por 15 minutos a 3500 rpm. Se filtró el sobrenadante por papel filtro de tamaño de poro de 2 a 3 µm, luego se volvió a filtrar por membrana PVDF de tamaño de poro de 0,45 µm a un vial ámbar para cromatografía. (Concentración aproximada: 0,01 mg/mL de Levotiroxina sódica). B. Determinación de interferencia de productos de degradación El diluyente, placebo, analito y analito más placebo se sometieron a diferentes medios de degradación (fotólisis, termólisis, degradación ácida, degradación alcalina y degradación oxidativa). Los resultados obtenidos de interferencia deben ser no significativos, presentando no más de 0,5 % de interferencia.24. El valor de pureza de pico se debe de encontrar entre 995 y 1000. 21 Placebo, analito y analito más placebo fueron evaluados por duplicado. Las muestras se inyectaron por duplicado. Para todas las degradaciones, se siguió con el procedimiento general de preparación de muestras, los cuales son escritos a continuación: Diluyente: Se midió con exactitud 5,0 mL de diluyente y se transfirió a una fiola de 50 mL. Se llevo a degradación. Culminado la degradación, se agregaron volumétricamente 20,0 mL de diluyente y se filtró por membrana PVDF de tamaño de poro de 0,45 µm a un vial ámbar para cromatografía. Placebo: Se realizó una medición precisa de aproximadamente 249,75 mg de placebo en una fiola de 50 mL, se agregó 5,0 mL de diluyente. Se llevó a degradación. Culminado la degradación, se agregaron volumétricamente 20,0 mL de diluyente y se llevó a baño de ultrasonido por 15 minutos con agitación intermitente. Se dejó atemperar las muestras, luego se llevó a centrifugar por 15 minutos a 3500 rpm. Se filtró el sobrenadante por papel filtro de tamaño de poro de 2 a 3 µm, luego se volvió a filtrar por membrana PVDF de tamaño de poro de 0,45 µm a un vial ámbar para cromatografía. Analito: Se procedió a medir con precisión una cantidad que correspondía a 25,0 mg de Levotiroxina sódica a una fiola de 500 mL, se agregó 200 mL de diluyente y se llevó al baño de ultrasonido por 5 minutos, se dejó enfriar a temperatura ambiente se diluyó hasta alcanzar el volumen de aforo. Se midió con exactitud 5,0 mL de la solución anterior y se llevó a una fiola de 50 mL. Se llevó a degradación. Culminado la degradación, se añadió volumétricamente 20,0 mL de diluyente, se llevó a baño de ultrasonido por 15 minutos con agitación intermitente, luego se centrifugó por 15 minutos a 3500 rpm. Se filtró el sobrenadante por papel filtro de tamaño de poro de 2 a 3 µm, luego se volvió a filtrar por membrana PVDF de tamaño de poro de 0,45 µm a un vial ámbar para cromatografía. (Concentración aproximada: 0,01 mg/mL de Levotiroxina sódica). Analito + Placebo: Se procedió a medir con precisión una cantidad que correspondía a 25,0 mg de Levotiroxina sódica a una fiola de 500 mL, se agregó 200 mL de diluyente y se llevó al baño de ultrasonido por 5 minutos, se dejó enfriar a temperatura ambiente y se diluyó hasta alcanzar el volumen de aforo. Se midió con exactitud 5,0 mL de la solución anterior y se llevó a una fiola de 50 mL, se 22 pesó con exactitud alrededor de 249,75 mg de placebo y se agregó a la fiola anterior. Se llevo a degradación. Culminado la preparación de diluyente, placebo, analito y analito más placebo, continuar según procedimiento de degradación especifica. B.1. Fotólisis: Las muestras fueron expuestas a radiación ultravioleta en una cámara, por cinco días. Culminado la degradación, se añadió volumétricamente 20,0 mL de diluyente, se llevó a baño de ultrasonido por 15 minutos con agitación intermitente, luego se llevó a centrifugar por 15 minutos a 3500 rpm. Se filtró el sobrenadante por papel filtro de tamaño de poro de 2 a 3 µm, luego se volvió a filtrar por membrana PVDF de tamaño de poro de 0,45 µm a un vial ámbar para cromatografía. (Concentración aproximada: 0,01 mg/mL de Levotiroxina sódica). B.2. Termólisis: Las muestras fueron expuestas a 40 °C por 48 horas en una estufa. Culminado la degradación, se añadió volumétricamente 20,0 mL de diluyente, se llevó a baño de ultrasonido por 15 minutos con agitación intermitente, luego se llevó a centrifugar por 15 minutos a 3500 rpm. Se filtró el sobrenadante por papel filtro de tamaño de poro de 2 a 3 µm, luego se volvió a filtrar por membrana PVDF de tamaño de poro de 0,45 µm a un vial ámbar para cromatografía. (Concentración aproximada: 0,01 mg/mL de Levotiroxina sódica). B.3. Hidrólisis ácida: Con 2,5 mL de HCl 0,5 N durante cuatro horas a 40 °C en una estufa y posterior neutralización con 2,5 mL NaOH 0,5 N. Culminado la degradación, se añadió volumétricamente 15,0 mL de diluyente, se llevó a baño de ultrasonido por 15 minutos con agitación intermitente, luego se llevó a centrifugar por 15 minutos a 3500 rpm. Se filtró el sobrenadante por papel filtro de tamaño de poro de 2 a 3 µm, luego se volvió a filtrar por membrana PVDF de tamaño de poro de 0,45 µm a un vial ámbar para cromatografía. (Concentración aproximada: 0,01 mg/mL de Levotiroxina sódica). B.4. Hidrólisis alcalina: Con NaOH 0,1 N durante cuatro horas a 40 °C y posterior neutralización con HCl 0,1 N. Culminado la degradación, se añadió volumétricamente 15,0 mL de diluyente, se llevó a baño de ultrasonido por 15 minutos con agitación intermitente, luego se llevó a centrifugar por 15 minutos a 3500 rpm. Se filtró el sobrenadante por papel filtro de tamaño de poro de 2 a 3 µm, luego se volvió a filtrar por membrana PVDF 23 de tamaño de poro de 0,45 µm a un vial ámbar para cromatografía. (Concentración aproximada: 0,01 mg/mL de Levotiroxina sódica). B.5. Degradación oxidativa: Con 5,0 mL de peróxido de hidrógeno al 0,3% v/v durante 15 minutos a 40 °C. Culminado la degradación, se añadió volumétricamente 15,0 mL de diluyente, se llevó a baño de ultrasonido por 15 minutos con agitación intermitente, luego se llevó a centrifugar por 15 minutos a 3500 rpm. Se filtró el sobrenadante por papel filtro de tamaño de poro de 2 a 3 µm, luego se volvió a filtrar por membrana PVDF de tamaño de poro de 0,45 µm a un vial ámbar para cromatografía. (Concentración aproximada: 0,01 mg/mL de Levotiroxina sódica). 3.3.2.3 Linealidad e Intervalo A. Intervalo de trabajo Para la especificación de 90,0 % a 110,0 % de ingrediente farmacéutico activo en el producto, el intervalo de trabajo es de 70 % a 130 %. Para lo cual se demuestra exactitud y precisión en dicho rango.24 Los resultados son tomados de la linealidad de método. B. Linealidad de sistema Se prepararon cinco concentraciones (50 %, 75 %, 100 %, 125 % y 150 % de la concentración nominal) a partir de una solución madre. Preparación de la solución madre de Levotiroxina sódica; dicha solución se preparó por triplicado: Se pesó con exactitud alrededor de 31,25 mg de Levotiroxina sódica y se transfirió a una fiola de 100 mL, se llevó al baño de ultrasonido por 5 minutos, se dejó enfriar a temperatura ambiente y se diluyó hasta alcanzar el volumen de aforo. De cada Solución madre, se midió 2, 3, 4, 5 y 6 mL y se transfirió a fiolas de 25 mL, se llevó a volumen con solución diluyente, se homogeneizó. Se midió 5,0 mL de cada fiola y se transfirió a fiolas de 50 mL, se agregó volumétricamente 20,0 mL de solución diluyente y se homogeneizó. Las soluciones se filtraron por membrana PVDF de tamaño de poro de 0,45 µm en viales ámbar para cromatografía. Las muestras se inyectaron por duplicado. C. Linealidad de método Se crearon mezclas del principio activo junto con excipientes en tres niveles de concentración diferentes (70 %, 100 % y 130 %). Las mediciones de peso se llevaron a cabo en forma individual y en triplicado. Al mismo tiempo, se prepararon 24 dos estándares de concentración conocida a un nivel de 100 % de la concentración prevista en el estudio, con el fin de ser contrastados con las muestras y así evaluar la exactitud de los resultados. Las muestras se inyectaron por duplicado. • Preparación de las muestras al 70 %: (por triplicado) Se pesó con exactitud una cantidad equivalente a 17,5 mg de Levotiroxina sódica, se transfirió a una fiola de 500 mL, luego se diluyó hasta alcanzar el volumen de aforo y se homogeneizó. Se midió con exactitud 5,0 mL de esta solución y se transfirió a una fiola de 50 mL, se añadió alrededor de 249,75 mg de placebo, luego agregó volumétricamente 20,0 mL de diluyente, se sometió a un baño de ultrasonido por 15 minutos con agitación intermitente, luego se llevó a centrifugar por 15 minutos a 3500 rpm. Se filtró el sobrenadante por papel filtro de tamaño de poro de 2 a 3 µm, luego se volvió a filtrar por membrana PVDF de tamaño de poro de 0,45 µm a un vial ámbar para cromatografía. (Concentración aproximada: 0,01 mg/mL de Levotiroxina sódica). • Preparación de las muestras al 100 %: (por triplicado). Se pesó con exactitud una cantidad equivalente a 25,0 mg de Levotiroxina sódica, se transfirió a una fiola de 500 mL, luego se diluyó hasta alcanzar el volumen de aforo y se homogeneizó. Se midió con exactitud 5,0 mL de esta solución y se transfirió a una fiola de 50 mL, se añadió alrededor de 249,75 mg de placebo, luego agregó volumétricamente 20,0 mL de diluyente, se sometió a un baño de ultrasonido por 15 minutos con agitación intermitente, luego se llevó a centrifugar por 15 minutos a 3500 rpm. Se filtró el sobrenadante por papel filtro de tamaño de poro de 2 a 3 µm, luego se volvió a filtrar por membrana PVDF de tamaño de poro de 0,45 µm a un vial ámbar para cromatografía. (Concentración aproximada: 0,01 mg/mL de Levotiroxina sódica). • Preparación de las muestras al 130 %: (por triplicado) Se pesó con exactitud una cantidad equivalente a 32,5 mg de Levotiroxina sódica, se transfirió a una fiola de 500 mL, luego se diluyó hasta alcanzar el volumen de aforo y se homogeneizó. Se midió con exactitud 5,0 mL de esta solución y se transfirió a una fiola de 50 mL, se añadió alrededor de 249,75 mg de placebo, luego agregó volumétricamente 20,0 mL de diluyente, se sometió a un baño de ultrasonido por 15 minutos con agitación intermitente, luego se llevó a centrifugar por 15 minutos a 3500 rpm. Se filtró el sobrenadante por papel filtro de tamaño de poro de 2 a 3 µm, luego se volvió a filtrar por membrana PVDF de tamaño de poro 25 de 0,45 µm a un vial ámbar para cromatografía. (Concentración aproximada: 0,01 mg/mL de Levotiroxina sódica). 3.3.2.4 Exactitud Para la evaluación de esta medida, se tomaron las muestras preparadas en la linealidad de método. La evaluación se realizó entre muestras y estándar de referencia. 3.3.2.4 Precisión A. Repetibilidad Se analizaron seis muestras de manera independiente, para lo cual se utilizó la metodología propuesta. B. Precisión Intermedia Un segundo analista realizó el análisis de seis muestras de manera independiente, utilizando la metodología propuesta. El análisis se realizó un día después al de la evaluación de la repetibilidad, en las mismas instalaciones, con materiales y equipos diferentes a los utilizados por el primer analista. 3.3.4. Cálculos 3.3.3.1 Precisión instrumental La desviación estándar relativa (RSD) de áreas y tiempos de retención se determinó aplicando las siguientes formulas.22: Desviación estándar: S = √ ∑( x − x̅)2 n − 1 RSD: rsd = s x̅ x 100 3.3.3.2 Especificidad A. Muestras sin degradar (interferentes) Las muestras de diluyente y placebo, no deben de mostrar una respuesta analítica (área). Valor de interferencia menor al 0,5 %.24 La pureza de pico principal en las muestras de analito y analito más placebo, se debe de encontrar entre 995 y 1000 (ausencia de coelución). 26 B. Muestras degradadas (productos de degradación) Las muestras de diluyente y placebo, no deben de mostrar una respuesta analítica (área) en el tiempo de retención del pico principal. Valor de interferencia menor al 0,5 %.24 La pureza de pico principal en las muestras de analito y analito más placebo, se debe de encontrar entre 995 y 1000 (ausencia de coelución). 3.3.3.2 Linealidad e Intervalo A. Regresión Lineal.24, 25 Ecuación de la recta: 𝑦=𝑏𝑥+𝑎 Donde: x: concentración del analito. y: respuesta del área del pico cromatográfico. b: pendiente de la recta. a: intercepto de la recta con el eje “y”. 𝑏 = 𝛴𝑥𝑦 − 𝛴𝑥𝛴𝑦 𝑛 𝛴𝑥𝑥 − (𝛴𝑥)2 𝑛 𝑎 = 𝛴𝑦 − 𝑏 𝛴𝑥 𝑛 B. Coeficiente de correlación (r) y coeficiente de determinación (r2).24, 25 Coeficiente de correlación (r): El coeficiente de correlación nos indica el grado de relación que existe entre la variable “x” (concentración), y la variable “y” (respuesta). Si (r) es cercano a la unidad, entonces significa que existe correlación con una probabilidad elevada. El valor de r debe ser mayor o igual a 0,999. 𝑟 = 𝛴𝑥𝑦 − 𝛴𝑥𝛴𝑦 𝑛 √(𝛴𝑥2 + (𝛴𝑥)2 𝑛 ) (𝛴𝑦2 − (𝛴𝑦)2 𝑛 ) 27 Coeficiente de determinación (r2) Este coeficiente indica la proporción de la variación total de la variable “y” (respuesta) explicada por la regresión. El valor de r2 debe ser mayor o igual a 0, 998. C. Varianza Residual Constante.24 La representación de los residuales aporta información acerca de la validez del modelo. Consiste en representar los residuales (eje de ordenadas) frente a los valores estimados (eje de abscisas). La distribución de los puntos debería ser aleatoria y no reflejar ninguna tendencia. D. Análisis de varianza: ANOVA.24 Antes de realizar el análisis ANOVA, primero se debe asegurar la homogeneidad de las varianzas, la cual se puede comprobar aplicando el Test de Cochran. Homogeneidad de varianzas (Test de Cochran) Test de Hipótesis para G exp Ho = Las varianzas son semejantes H1 = Las varianzas son diferentes 𝐺𝑒𝑥𝑝 = 𝑆𝑚á𝑥𝑖𝑚𝑎 2 𝑆1 2 + 𝑆2 2 + 𝑆3 2 + . . . + 𝑆𝑖 2 Dónde: 𝑆𝑖 2 = 𝑣𝑎𝑟𝑖𝑎𝑛𝑧𝑎 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑑𝑎 𝑔𝑟𝑢𝑝𝑜(𝑘) 𝑆𝑚á𝑥𝑖𝑚𝑎 2 = 𝑣𝑎𝑟𝑖𝑎𝑛𝑧𝑎 𝑚á𝑥𝑖𝑚𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑜𝑠 𝑘 𝑔𝑟𝑢𝑝𝑜𝑠 Criterio de aceptación: Si Gexp < Gtabla, para una probabilidad del 95% (p=0,05) y K = 5, n = 3, se acepta la hipótesis nula (Ho), entonces las varianzas no son estadísticamente diferentes entre sí. ANOVA Test de Hipótesis Ho: β = 0 El modelo lineal No proporciona un buen ajuste a los datos H1: β ≠ 0 El modelo lineal Si proporciona un buen ajuste a los datos 28 Criterio de aceptación: Si Fexp ˃ Ftabla, para una probabilidad del 95% (p=0,05), se rechaza la hipótesis nula (Ho), demostrando la existencia de una pendiente distinta de 0, esto nos indica que el modelo lineal si proporciona un buen ajuste a los datos. E. Test de linealidad.24 Coeficiente de variación de los factores de respuesta (f) 𝑓 = 𝑦 𝑥 Criterio de aceptación: C.V. (%) ≤ 2 % Donde: y = Respuesta cromatográfica (áreas) x = Concentración de analito en mg/mL Significación estadística de la desviación estándar de la pendiente. Test de Hipótesis para la pendiente “b”: Ho: “b” es estadísticamente igual a cero. H1: “b” es estadísticamente diferente a cero. Criterio de aceptación: Si t exp. > t tabla para una probabilidad del 95% (p = 0,05) y (n-2) grados de libertad, se rechaza la Hipótesis nula (Ho), entonces “b” es estadísticamente diferente de cero. El intervalo de confianza no incluye el cero. F. Test de proporcionalidad.24 Este parámetro estadístico nos permite evaluar si la recta pasa por el origen de las coordenadas, determinando si la variable independiente es significativamente distinta de cero. Test de Hipótesis para el intercepto “a”: Ho: “a” es estadísticamente igual a cero. H1: “a” es estadísticamente diferente a cero. Criterio de aceptación: Si t exp. < t tabla para una probabilidad del 95% (p = 0,05) y (n-2) grados de libertad, se rechaza la Hipótesis nula (Ho), entonces “a” es estadísticamente diferente de cero. 29 3.3.3.3 Exactitud.24 %𝑅 = 𝑋𝐻 𝑥 100 𝑋𝐴 Donde: %𝑅 : porcentaje de recuperación. 𝑋H : cantidad de analito hallado. 𝑋A : cantidad de analito añadido Criterio de aceptación: El porcentaje de recuperación debe encontrase entre 98 % y 102 %. 3.3.3.4 Precisión24. A. Repetibilidad Para la evaluación de este parámetro se analizó 6 muestras. El C.V. (%) debe ser menor o igual a 2 %. B. Precisión Intermedia Para la evaluación de este parámetro un segundo analista analizó la muestra. Los resultados del primer y segundo analista fueron comparados, el C.V. (%) debe ser menor o igual a 2 % con respecto a primer analista (prueba de repetibilidad). 3.3.5. Análisis de datos Los resultados obtenidos producto de cada prueba realizada para la evaluación de los diferentes parámetros de validación, fueron sometidos a análisis estadístico utilizado el programa Excel de Microsoft Office Profesional Plus 2019. Las pruebas estadísticas utilizadas fueron ANOVA y t de Student. con un 95 % de confianza. 31 IV. RESULTADOS 33 Tabla 3. Pureza de pico cromatográfico en muestras que contienen levotiroxina sódica al evaluar la especificidad. Lima-2022. Levotiroxina sódica Número Pureza de pico cromatográfico In te rf e re n c ia s Analito 1 999,997 999,997 2 999,998 999,998 Analito + Placebo 1 999,973 999,990 2 999,986 999,996 34 Tabla 4. Porcentaje de recuperación de analito, en la evaluación de la especificidad- interferencias. Lima-2022. Levotiroxina sódica N° Peso (mg) Añadido (mg) Hallado (mg) Promedio hallado (mg) % Recuperación In te rf e re n c ia s Placebo 1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Analito 1 28,09 25,17 25,20485 25,23 100,24 25,24910 2 27,86 24,96 25,03006 25,00 100,16 24,97413 Analito + Placebo 1 29,07 26,05 26,18546 26,20 100,58 26,21392 2 28,20 25,27 25,51875 25,52 100,99 25,51526 35 Tabla 5. Pureza de pico cromatográfico en muestras que contienen levotiroxina sódica, sometidas a degradación forzada. Lima-2022. Levotiroxina sódica N° Pureza de pico cromatográfico F o tó lis is Analito 1 995,132 995,131 2 995,134 995,131 Analito + Placebo 1 995,348 995,341 2 995,346 995,345 T e rm ó lis is Analito 1 999,954 999,952 2 999,958 999,954 Analito + Placebo 1 998,239 998,237 2 998,231 998,233 H id ró lis is á c id a Analito 1 999,994 999,996 2 999,992 999,991 Analito + Placebo 1 999,991 999,992 2 999,991 999,993 H id ró lis is a lc a lin a Analito 1 999,990 999,991 2 999,992 999,991 Analito + Placebo 1 999,958 999,957 2 999,954 999,956 D e g ra d a c ió n o x id a ti v a Analito 1 999,998 999,997 2 999,998 999,998 Analito + Placebo 1 999,994 999,993 2 999,992 999,991 36 Figura 2. Curva de calibración de concentración versus área, para la evaluación de la linealidad del sistema, del método analítico. Lima-2022. y = 390111,2118x + 22,1289 R² = 0,9997 1600.0 2100.0 2600.0 3100.0 3600.0 4100.0 4600.0 5100.0 5600.0 6100.0 6600.0 0.003 0.005 0.007 0.009 0.011 0.013 0.015 0.017 0.019 Á re a Concentración (mg/mL) Linealidad del sistema 37 Figura 3. Curva de calibración de concentración versus área, para la evaluación de la linealidad del método analítico y exactitud. Lima-2022. y = 396253x - 60,46 R² = 0,9996 2500.0 3000.0 3500.0 4000.0 4500.0 5000.0 5500.0 0.005 0.010 0.015 Á re a Concentración (mg/mL) Linealidad del Método 38 Tabla 6. Porcentaje de recuperación del analito (levotiroxina sódica) en presencia de placebo. Para la evaluación de la exactitud. Lima – 2022. C o n c e n tr a c ió n M u e s tr a P e s o ( m g ) A n a lit o a ñ a d id o ( m g ) A n a lit o h a lla d o ( m g ) P ro m e d io d e a n a lit o h a lla d o ( m g ) R e c u p e ra c ió n % 70% M1 19,48 17,45 17,38432 17,38 99,60 17,38450 M2 19,86 17,79 17,66060 17,67 99,33 17,67171 M3 19,46 17,44 17,12998 17,17 98,45 17,20717 100% M1 28,34 25,39 25,37680 25,37 99,92 25,37067 M2 27,86 24,96 24,73490 24,74 99,12 24,73710 M3 28,25 25,31 25,17944 25,19 99,53 25,19727 130% M1 36,11 32,35 32,55369 32,61 100,80 32,65844 M2 36,61 32,80 32,82972 32,83 100,09 32,82872 M3 36,58 32,78 32,59836 32,58 99,39 32,57076 Promedio 99,58 RSD 0,66 39 Tabla 7. Desviación estándar relativa, del porcentaje obtenido de levotiroxina sódica, entre analista 1 y analista 2, para la evaluación de la repetibilidad y precisión intermedia en tabletas que contienen levotiroxina sódica. Lima – 2022. Muestra Analista 1 Analista 2 Levotiroxina sódica (µg/tab.) Promedio levotiroxina sódica (µg/tab.) % Levotiroxina sódica (µg/tab.) Promedio levotiroxina sódica (µg/tab.) % M1 100,09 100,08 100,1 100,56 100,57 100,6 100,07 100,58 M2 100,26 100,27 100,3 100,36 100,37 100,4 100,28 100,37 M3 100,14 100,15 100,1 100,74 100,75 100,7 100,15 100,75 M4 100,02 100,04 100,0 100,41 100,41 100,4 100,05 100,40 M5 100,65 100,65 100,6 100,12 100,12 100,1 100,64 100,11 M6 100,21 100,23 100,2 100,35 100,35 100,4 100,24 100,35 Promedio 100,2 Promedio 100,4 RSD 0,22 RSD 0,21 Promedio entre analista 1 y 2 100,3 RSD entre analista 1 y 2 0,14 41 V. DISCUSIÓN La cromatografía líquida de alto rendimiento es una técnica analítica que presenta ventajas sobre los métodos tradicionales de análisis como: el IR y espectrofotometría UV-VIS, esto debido a que se puede realizar una separación de los componentes de una muestra, con lo cual podemos identificar y cuantificar el analito de manera inequívoca. Se pude obtener una técnica analítica con tiempos de análisis rápidos, separación de sustancias de mezclas complejas con alta resolución, ejecución de análisis con facilidad y exactitud.3 Se realizo la evaluación de los parámetros de validación según USP, ICH, AEFI. En la tabla 3; se muestran los resultados de especificidad. En la cual evalúa la pureza de pico cromatográfico en muestras que contienen el analito (levotiroxina sódica). Las muestras analizadas fueron analito y analito más placebo y los resultados fueron en promedio 999,998 y 999,986 para analito y analito más placebo respectivamente. La AEFI24 en su libro sobre “validación de métodos analíticos” indica que la para las pruebas de especificidad no debe de existir una interferencia mayor al 0,5 %, es decir que, para la evaluación de la pureza de pico cromatográfico, donde la escala de medición va de 0 a 1000, los resultados de pureza de pico deben ser mayores a 995. Los resultados obtenidos demuestran que el analito y analito en presencia de placebo, al ser analizados por el método propuesto son específicos y que la matriz del producto no interfiere con el pico cromatográfico de interés. Bocanegra11, en su estudio de validación de método analítico por cromatografía líquida de alta resolución para determinar vitaminas hidrosolubles en solución endovenosa inyectable, pudo obtener purezas de pico de no menos de 0,99, en una escala de 0 a 1. En la tabla 4; se muestran los porcentajes de recuperación obtenidos para la prueba de especificidad. Resultado de posibles interferencias en porcentaje de 42 recuperación. Las muestras analizadas fueron analito y analito más placebo y los resultados fueron en promedio 100,2 % y 100,8 % para analito y analito más placebo respectivamente. La farmacopea norteamericana (USP16) indica que, la especificidad en el caso de las pruebas de valoración del principio activo, proporcionan un resultado exacto, la cual nos permite una declaración exacta del contenido en una muestra. Los criterios de aceptación para la exactitud se encuentran en un rango de entre 98 – 102 %.24. Los resultados demuestran que el analito y analito en presencia de placebo, al ser analizados por el método propuesto llegan a tener una recuperación del activo muy buena y que la matriz del producto no interfiere con los resultados. En la tabla 5; se muestran los resultados de especificidad. Resultado de pureza de pico de levotiroxina sódica en muestras sometidas a degradación forzada: fotólisis, termólisis, hidrólisis ácida, hidrólisis alcalina y degradación oxidativa. En el caso de la fotólisis, las muestras de analito y analito más placebo dieron como resultado valores promedio de 995,132 y 995,345 respectivamente. Para la termólisis, las muestras de analito y analito más placebo dieron como resultado valores promedio de 999,955 y 998,235 respectivamente. Los resultados de hidrólisis ácida, en muestras de analito y analito más placebo, fueron en promedio 999,993 y 999,992 respectivamente. Para la hidrólisis alcalina, los resultados de analito y analito más placebo en promedio fueron 999,991 y 999,956 respectivamente. Para la degradación oxidativa, las muestras de analito y analito más placebo dieron como resultado valores promedio de 999,998 y 999,993 respectivamente. La AEFI24 en su libro sobre “validación de métodos analíticos” indica que, en los estudios de muestras sometidas a estrés, se debe comprobar la identidad del analito y que la señal proviene solo de él. Para las pruebas de especificidad no debe de existir una interferencia mayor al 0,5 %, es decir que, para la evaluación de pureza de pico, donde la escala de medición es de 0 a 1000, los resultados de pureza de pico deben ser mayores a 995. Los resultados de muestras sometidas a estrés (fotólisis, termólisis, hidrólisis ácida, hidrólisis alcalina, degradación oxidativa), demuestran que las muestras que contienen analito y las muestras que contienen analito en presencia de placebo, al ser analizados por el método propuesto son específicos y la degradación a la que fue sometida, no interfiere con la respuesta cromatográfica del analito de interés. Un estudio realizado por Bocanegra11, para la validación de método analítico por cromatografía líquida de alta resolución para determinar vitaminas hidrosolubles 43 en solución endovenosa inyectable, mostró resultados de pureza de pico cromatográfico para la degradación oxidativa entre 0,75 a 0,79. En la figura 2 y anexo 7; se presentan los resultados de la curva de calibración de la evaluación de la linealidad de del sistema. El resultado obtenido como ecuación de la recta fue, y = 390111,2118x + 22,1289. Además, el resultado obtenido de la evaluación de la ecuación de la recta nos permitió obtener un coeficiente de determinación r2 = 0,9997 y un coeficiente de correlación r = 0,9998. En la figura 3 y anexo 8; Se muestran los resultados de la evaluación de la linealidad del método. El análisis de la ecuación de la recta no proporciono el valor del coeficiente de determinación r2 = 0,9996, así como también el del coeficiente de correlación r = 0,9998. La AEFI24, nos indica que el valor para que el coeficiente de correlación pueda ser aceptado, debe ser mayor a 0,999. Para Gary26, el coeficiente de determinación, obtenido como resultado de la evaluación de la linealidad debe ser mayor que 0,998. Los resultados obtenidos nos indican que existe un alto grado de relación entre las variables de concentración y respuesta, por lo tanto, podemos decir que el resultado obtenido es lineal. En el anexo 13 se presenta el resumen de la evaluación estadística de la linealidad de método y sistema, los estadísticos utilizados fueron: el test de ANOVA y el estadístico de Fisher. Antes de realizar el estadístico de ANOVA, se verificó la homogeneidad de las varianzas mediante el test de Cochran, donde G exp < G tablas.24, los resultados obtenidos fueron 0,60 < 0,68 y 0,47 < 0,87 para linealidad de sistema y método respectivamente. Se realizó el ANOVA para una probabilidad del 95% (p=0,05), donde F exp > F tabla.24, los resultados obtenidos fueron 38836,52 > 4,67 y 16469,51 > 5,59 para linealidad de sistema y método respectivamente. Estos resultados nos indican que el modelo lineal si proporciona un buen ajuste a los datos. En el anexo 13 también encontramos los resultados de Coeficiente de variación de los factores de respuesta (f), donde C.V. (%) es menor al 2 %.24 Los resultados obtenidos fueron 0,91 % y 0,66 % para linealidad de sistema y linealidad de método respectivamente. Los resultados nos indican que existe una buena relación entre la respuesta (área) y la concentración. Se analizó la pendiente de la recta de calibración, mediante la prueba de t de Student para n-2 grados de libertad y un grado de significación de p = 0,05, donde t exp > t tabla.24 Se tuvieron resultados de 197,07 > 2,16 y 128,33 > 2,36 para linealidad de sistema y método respectivamente. Los resultados nos indican que existe una pendiente significativamente distinta de cero. También se realizó el análisis 44 estadístico de del intercepto (test de proporcionalidad), para lo cual se utilizó el estadístico t de Student para n-2 grados de libertad y un grado de significación de p = 0,05, donde t exp < t tabla.24 El resultado fue de 1,05 < 2,16 y 1,89 < 2,36 para linealidad de sistema y método respectivamente. Con estos resultados podemos decir que la recta pasa por el origen de las coordenadas, además que la variable independiente es significativamente distinta de cero. Bardales et al.12 realizo un estudio sobre validación por HPLC para la valoración de cloruro de benzalconio en Gentamicina 0,3 % solución oftálmica, donde obtuvo un valor de r = 0,9998 como coeficiente de variación. En la tabla 6; se muestra los resultados de la evaluación de la exactitud. Según la AEFI24, el criterio de aceptación para la recuperación, debe de estar entre 98,0 - 102,0 %. El resultado obtenido fue 99,58 %. Además, los resultados deben de cumplir con criterios de precisión, para lo cual se determinó el coeficiente de variación recomendado por USP16, la cual nos indica que el valor de C.V debe ser menos del 2 %, El resultado obtenido de C.V fue de 0,66 %. Esto nos indica que el método analítico nos permite hacer una buena recuperación del analito en el intervalo de trabajo de 70 % a 130 %. Bardales et al.12 en su estudio de validación por HPLC para la valoración de cloruro de benzalconio en Gentamicina 0,3% solución oftálmica, logró obtener un porcentaje de exactitud de 99,88 %. Los resultados obtenidos en ambos se encuentran cerca del valor verdadero teórico. En la tabla 7; se muestra la evaluación de la repetibilidad y precisión intermedia para la cuantificación de levotiroxina sódica en tabletas. Según AEFI24, para cumplir con el criterio de aceptación el resultado de C.V. (%) debe ser menor o igual a 2 %. Los resultados obtenidos fueron 0,22 % y 0,14 % para repetibilidad y precisión intermedia respectivamente. Choque14, en su trabajo de investigación sobre validación por HPLC para la cuantificación de clorhidrato de clorhexidina + benzocaína + enoxolona en comprimidos orales, pudo encontrar un C.V. de 0,40 % para benzocaína, 1,25 % para clorhexidina HCl y 0,85 % para enoxolona. 45 VI. CONCLUSIONES 1. El método analítico por cromatografía liquida de alto rendimiento (HPLC) para la cuantificación de Levotiroxina sódica en tabletas cumple con los parámetros de validación. 2. En la evaluación del parámetro de especificidad, no se observaron interferencias significativas obteniendo una recuperación de 100,2 % y 100,8 % para analito y analito más placebo respectivamente, además se verificó que existe una alta pureza de pico en analito y analito más placebo 999,998 y 999,986 respectivamente. En las degradaciones se observó una alta pureza de pico siendo estas mayores a 999,5 en todas las condiciones de estudio. Estos resultados demuestran que el método analítico es específico. 3. La linealidad del sistema nos mostró un coeficiente de determinación de r2 = 0,9997. Para la linealidad del método el resultado del coeficiente de determinación fue de r2 = 0,9996. Por lo cual se verificó que existe un buen desempeño del método analítico en el Intervalo de trabajo de 70 % a 130 %. Demostrando así que el método analítico es lineal en el intervalo de trabajo. 4. Se observó un buen desempeño del método analítico en la evaluación de la exactitud, en el intervalo de trabajo de 70 % a 130 %, dando como resultado una recuperación de 99,58 %. Para la precisión del método analítico, el resultado de repetibilidad y precisión intermedia fue de 0,22 % y 0,14 % respectivamente. Demostrando que el método analítico es exacto y preciso. 47 VII. RECOMENDACIONES 1. Se recomienda seguir los pasos establecidos en la metodología para obtener resultados reproducibles. Es necesario hacer una correcta molienda de las tabletas, para así poder lograr una mezcla homogénea. 2. La metodología validada debe ser considerada y aplicada en el análisis de productos que contienen levotiroxina sódica como IFA. La metodología garantiza la obtención de resultados confiables. 3. Si se desea trabajar con tabletas que contengan diferente proporción de analito y placebo. Se recomienda realizar una evaluación de la linealidad de método a las mismas concentraciones de analito utilizado en la presente validación. 49 VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Cordero R. Guía para la Validación de Métodos Analíticos de Jarabes por Cromatografía Líquida de Alta Resolución en un Laboratorio Farmacéutico (Maestría en gestión de la calidad). Guatemala. Universidad de San Carlos de Guatemala; 2019. 2. Organización Panamericana de salud [Internet]. Washington DC. 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México: Mc Graw Hill; 2009. https://www.digemid.minsa.gob.pe/registro-sanitario/medicamentos https://www.digemid.minsa.gob.pe/registro-sanitario/medicamentos 53 ANEXOS 55 Anexo 1. Desviación estándar de tiempos de retención y áreas en la evaluación de la precisión instrumental de inyecciones repetidas de una muestra de levotiroxina sódica. Lima-2022. Número de inyecciones TR (minutos) Áreas 1 11,23859 3946,19727 2 11,23632 3948,38770 3 11,23699 3949,77881 4 11,23704 3953,58374 5 11,23840 3955,87354 6 11,23705 3951,21973 Promedio 11,23739 3950,84013 RSD 0,01 0,09 56 Anexo 2. Especificidad - Interferencias. Resultado de pureza de pico de analito (levotiroxina sódica). Lima-2022. 57 Anexo 3. Especificidad - Interferencias. Resultado de pureza de pico de analito (levotiroxina sódica) en presencia de placebo. Lima-2022. 58 Anexo 4. Espectro tridimensional de estándar de Levotiroxina sódica. Lima-2022. Donde: eje x : tiempo en minutos eje y : unidades de absorbancia eje z : longitud de onda en nanómetros (nm) 59 Anexo 5. Espectro tridimensional de muestra (Levotiroxina sódica tableta). Lima- 2022. Donde: eje x : tiempo en minutos eje y : unidades de absorbancia eje z : longitud de onda en nanómetros (nm) 60 Anexo 6. Identificación. Comparación de muestra que contiene el analito con base de datos (espectros) de diferentes estándares de referencia. Lima-2022 Conc. Dato x y f (y/x) Varianza (n) (mg/mL) ( s2 ) 50% 1 0.00505 2033.55933 402982.50 37672032.551652 2 0.00493 1953.96485 395984.23 3 0.00502 1961.74396 390749.28 75% 1 0.00757 2943.48560 388866.02 8968793.316157 2 0.00740 2921.71949 394737.51 3 0.00753 2942.82300 390776.78 100% 1 0.01009 3956.23364 391995.68 2421609.636938 2 0.00987 3882.13171 393370.16 3 0.01004 3918.62195 390264.67 125% 1 0.01262 4936.51294 391299.79 4760026.605360 2 0.01234 4865.83179 394437.52 3 0.01255 4898.00074 390242.62 150% 1 0.01514 5918.97778 390980.23 8720769.440567 2 0.01480 5851.43140 395277.42 3 0.01506 5868.22095 389619.84 SUMA 15 62543231.55067 61 Anexo 7. Estadísticas de curva de calibración de concentración versus área, para la evaluación de la linealidad del sistema, del método analítico. Lima-2022. Estadísticas de la regresión Coeficiente de correlación 0,9998 Coeficiente de determinación R2 0,9997 Observaciones 15 62 Anexo 8. Estadísticas de curva de calibración de concentración versus área, para la evaluación de la linealidad del método analítico y exactitud. Lima – 2022. Estadísticas de la regresión Coeficiente de correlación 0,9998 Coeficiente de determinación R2 0,9996 Observaciones 9 63 Anexo 9. Resumen de datos y resultados de linealidad de sistema. Lima-2022. C o n c e n tr a c ió n D a to ( n ) P e s o ( m g ) x (mg/mL) Áreas y Promedio de áreas f (y/x) 50 % M1 35,20 0,00505 2034,86206 2033,55933 402982,50 2032,25659 M2 34,42 0,00493 1951,41663 1953,96485 395984,23 1956,51306 M3 35,02 0,00502 1961,47327 1961,74396 390749,28 1962,01465 75 % M1 35,20 0,00757 2930,53589 2943,48560 388866,02 2956,43530 M2 34,42 0,00740 2922,14502 2921,71949 394737,51 2921,29395 M3 35,02 0,00753 2943,04297 2942,82300 390776,78 2942,60303 100 % M1 35,20 0,01009 3952,80151 3956,23364 391995,68 3959,66577 M2 34,42 0,00987 3880,69653 3882,13171 393370,16 3883,56689 M3 35,02 0,01004 3917,22949 3918,62195 390264,67 3920,01440 125 % M1 35,20 0,01262 4930,19922 4936,51294 391299,79 4942,82666 M2 34,42 0,01234 4865,66064 4865,83179 394437,52 4866,00293 M3 35,02 0,01255 4896,32129 4898,00074 390242,62 4899,68018 150 % M1 35,20 0,01514 5922,15234 5918,97778 390980,23 5915,80322 M2 34,42 0,01480 5854,26709 5851,43140 395277,42 5848,59570 M3 35,02 0,01506 5863,34326 5868,22095 389619,84 5873,09863 64 Anexo 10. Residuales, concentración versus residuos, para la evaluación de la aleatoriedad de los resultados en la prueba de linealidad de sistema. Lima- 2022. -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60 0.00 0.01 0.01 0.02 0.02 R e s id u o s Concentración (mg/mL) Gráfico de residuales 65 Anexo 11. Resumen de datos y resultados de linealidad de método. Lima-2022. C o n c e n tr a c ió n D a to ( n ) P e s o ( m g ) x (mg/mL) Áreas y Promedio de áreas f (y/x) 70 % M1 19,48 0,00698 2722,63159 2722,64551 389972,65 2722,65942 M2 19,86 0,00712 2765,90210 2766,77149 385526,83 2767,64087 M3 19,46 0,00697 2682,79810 2688,84302 387982,08 2694,88794 100 % M1 28,34 0,01016 3974,36865 3874,01038 394579,17 3973,40796 M2 27,86 0,00999 3873.83813 5106,57422 389252,46 3874,18262 M3 28,25 0,01012 3943,45825 5103,20557 388710,30 3946,25073 130 % M1 36,11 0,01294 5098,37158 3973,88831 391244,11 5114,77686 M2 36,61 0,01312 5141,60107 3944,85449 389622,95 5141,44531 M3 36,58 0,01311 5105,36670 5141,52319 391853,81 5101,04443 66 Anexo 12. Residuales, concentración versus residuos, para la evaluación de la aleatoriedad de los resultados en la prueba de linealidad de método. Lima-2022. -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010 0.012 0.014 R es id u o s Concentración (mg/mL) Gráfico de los residuales 67 Anexo 13. Resultados y evaluación estadística de la linealidad. Lima-2022. PARÁMETROS LÍMITES RESULTADOS Linealidad: Linealidad de Sistema Ecuación de la recta 𝑦=𝑏𝑥±𝑎 y = 390111,21x + 22,13 Coeficiente de correlación Mayor a 0,999 0,9998 Coeficiente de determinación Mayor a 0,998 0,9997 Homogeneidad de varianzas (Test de Cochran) G exp < G tablas 0,60 < 0,68 Tes de ANOVA F exp > F tabla 38836,52 > 4,67 Tes de Linealidad: Coeficiente de Variación de los Factores de Respuesta “f” RSD ≤ 2% 0,91 % Intervalo de confianza de la b ± t tabla. Sb 385834,64 - 394387,79 pendiente “b” t exp > t tabla 197,07 > 2,16 Tes de Proporcionalidad Intervalo de confianza del a ± t tabla. Sa -23,24 - 67,49 intercepto “a” t exp < t tabla 1,05 < 2,16 Linealidad de Método Ecuación de la recta 𝑦=𝑏𝑥±𝑎 y = 396253,44x - 60,46 Coeficiente de correlación Mayor a 0,999 0,9998 Coeficiente de determinación Mayor a 0,998 0,9996 Homogeneidad de varianzas (Test de Cochran) G exp < G tablas 0,47 < 0,87 Tes de ANOVA F exp > F tabla 16469,51 > 5,59 Tes de Linealidad: Coeficiente de Variación de los Factores de Respuesta “f” RSD ≤ 2% 0,66 % Intervalo de confianza de la b ± t tabla. Sb 388952,23 - 403554,65 pendiente “b” t exp > t tabla 128,33 > 2,36 Tes de Proporcionalidad Intervalo de confianza del a ± t tabla. Sa -136,06 - 15,14 intercepto “a” t exp < t tabla 1,89 < 2,36 68 Anexo 14: Matriz de consistencia TITULO: “Validación de un método analítico por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para la cuantificación de Levotiroxina sódica en tabletas”. Lima-2022. AUTOR: SICHA GUTIERREZ, Michel. TITULO PROBLEMA OBJETIVOS HIPÓTESIS VARIABLES MARCO TEÓRICO METODOLOGÍA Validación de un método analítico por cromatogra fía líquida de alto rendimiento (HPLC) para la cuantificaci ón de Levotiroxin a sódica en tabletas, Lima – 2021. ¿Será confiable el método analítico para la cuantificación de Levotiroxina sódica en tabletas por cromatografía liquida de alto rendimiento (HPLC), para obtener resultados dentro de las especificacion es establecidas en el protocolo de validación? General: Validar un método analítico para la cuantificación de Levotiroxina sódica en tabletas por cromatografía liquida de alto rendimiento (HPLC) y documentar los resultados obtenidos Objetivos específicos: •Determinar la especificidad del método analítico. •Determinar la linealidad del sistema, linealidad del método y el intervalo del método analítico. •Determinar la exactitud, repetibilidad y precisión intermedia del método analítico. La validación de un método analítico por cromatografía liquida de alto rendimiento (HPLC) para la cuantificación de Levotiroxina sódica en tabletas, es confiable para obtener los resultados dentro de las especificaciones establecidas en el protocolo de validación. Variable principal: Validación de un método analítico por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Indicadores: Parámetros de validación: - Especificidad - Linealidad - Precisión - Exactitud - Intervalo Validación Es un proceso que establece, mediante estudios de laboratorio, que las características de desempeño del procedimiento, cumplen los requisitos para las aplicaciones analíticas previstas. Para la cuantificación de ingredientes activos en muestra de sustancia o fármacos la ICH y la USP establece la evaluación de los siguientes parámetros de validación: - Especificidad - Linealidad - Precisión - Exactitud - Intervalo Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) Es un tipo de cromatografía de elución versátil y ampliamente utilizado como una técnica de separación, basada en una fase estacionaria sólida y una fase móvil líquida, que se emplean para separar los componentes de una muestra. El gran poder de la cromatografía reside en la combinación de un amplio intervalo de posibles propiedades