i UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTÓBAL DE HUAMANGA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA Efecto antagónico in vitro de cepas nativas de Trichoderma sp. frente a los hongos fitopatógenos Colletotrichum sp. y Fusarium sp. Ayacucho, 2018. TESIS PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL DE BIÓLOGA EN LA ESPECIALIDAD DE MICROBIOLOGÍA Presentado por la: Bach. AYALA QUISPE, Esther Fanni AYACUCHO – PERÚ 2019 ii iii Con amor eterno a Dios, a mis padres. iv v AGRADECIMIENTO A mi Alma Mater, la Universidad Nacional de San Cristóbal de Huamanga y en particular a la Facultad de Ciencias Biológicas y a todos los docentes por haberme brindado las facilidades para el logro, materialización y que contribuyeron en mi formación como profesional y persona útil para nuestra sociedad. A mi asesora Blga. Ruth Elsa Huamán De La Cruz, asesora del presente trabajo de investigación, por su apoyo incondicional, paciencia, orientación y sabios consejos, que han permitido culminar con mi trabajo de tesis. Al Blgo. Reynán Cóndor Alarcón, por el apoyo incondicional en la sistematización de la información. Al Ing. M.Sc. Fernando Barrantes Del Águila por el apoyo brindado en la identificación de las cepas aisladas, por su gran espíritu de solidaridad. vi vii ÍNDICE GENERAL Pág. DEDICATORIA iii AGRADECIMIENTO v ÍNDICE GENERAL vii ÍNDICE DE TABLAS ix ÍNDICE DE FIGURAS xi ÍNDICE DE ANEXOS xiii RESUMEN xv I. INTRODUCCIÓN 1 II. MARCO TEÓRICO 3 2.1. Antecedentes 3 2.1.1. A nivel internacional 3 2.1.2. A nivel nacional 4 2.2. Marco conceptual 5 2.2.1. Antagonismo 5 2.2.2. Trichoderma 6 2.2.3. Colletotrichum 10 2.2.4. Fusarium 13 2.2.5. Técnica de enfrentamiento dual 15 2.2.6. Cepas nativas 16 III. MATERIALES Y METODOS 17 3.1. Ubicación 17 3.1.1. Ubicación del lugar de muestreo 17 3.1.2. Lugar de ejecución 17 3.2. Materiales 17 3.2.1. Material biológico 17 3.3. Diseño metodológico 17 3.3.1. Recolección de muestras 17 3.3.2. Aislamiento de cepas antagonistas y fitopatógenos 18 3.3.3. Identificación por microcultivo 19 3.3.4. Determinación del efecto antagónico 19 3.4. Tipo de investigación 20 3.5. Diseño de investigación 20 3.6. Análisis de datos 21 viii 3.6.1. Determinación del porcentaje de inhibición radial del crecimiento (PIRC) 21 3.7. Análisis estadístico 22 3.8. Determinación del Micoparasitismo 22 IV. RESULTADOS 23 V. DISCUSIÓN 37 VI. CONCLUSIONES 41 VII. RECOMENDACIONES 43 VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 45 ANEXOS 53 ix ÍNDICE DE TABLAS Pág. Tabla 1. Tratamientos para la prueba de efecto antagónico. 21 Tabla 2. Escala de categoría de inhibición de crecimiento PICR. 21 Tabla 3. Escala creada por Elías y Arcos (1984), Creada para la evaluación de la capacidad antagónica (micoparasitismo). 22 Tabla 4. Relación de cepas de hongos antagonistas y fitopatógenos aislados. 25 Tabla 5. Porcentaje de inhibición del crecimiento radial de Colletotrichum sp cepa AV-1 en cultivo dual con Trichoderma spp. 26 Tabla 6. Porcentaje de inhibición del crecimiento radial de Colletotrichum sp. cepa AV-2 en cultivo dual con Trichoderma spp. 27 Tabla 7. Porcentaje de inhibición del crecimiento radial de Colletotrichum sp. cepa RF-1 en cultivo dual con Trichoderma spp. 28 Tabla 8. Porcentaje de inhibición del crecimiento radial de Colletotrichum sp. cepa RF-2 en cultivo dual con Trichoderma spp. 29 Tabla 9. Porcentaje de inhibición del crecimiento radial de Fusarium sp. cepa F-1 en cultivo dual con Trichoderma spp. 30 Tabla 10. Porcentaje de inhibición del crecimiento radial de Fusarium sp. cepa F-2 en cultivo dual con Trichoderma spp. 31 Tabla 11. Porcentaje de inhibición del crecimiento radial de Fusarium sp. cepa F-3 en cultivo dual con Trichoderma spp. 32 Tabla 12. Porcentaje de inhibición del crecimiento radial de Fusarium sp. cepa F-4 en cultivo dual con Trichoderma spp. 33 Tabla 13. Grado de invasión de cepas nativas de Trichoderma spp. en Colletotrichum spp. (Según Elías y Arcos, 1984). 34 Tabla 14. Grado de invasión de cepas nativas de Trichoderma spp. en Fusarium spp. (Según Elías y Arcos, 1984). 35 x xi ÍNDICE DE FIGURAS Pág. Figura 1. La medición de crecimiento radial del micelio del fitopatógeno por el método de cultivo dual. 20 xii xiii ÍNDICE DE ANEXOS Pág. Anexo 1. Observaciones macroscópicas y microscópicas (40X) de cepas de Trichoderma spp., aisladas de suelo. 55 Anexo 2. Observaciones macroscópicas y microscópicas (100X) de conidios de Colletotrichum spp. 58 Anexo 3. Observaciones macroscópicas y microscópicas (100X) de macro y microconidias de Fusarium spp. 59 Anexo 4. Constancia de las cepas aisladas y estudiadas. 60 Anexo 5. Categoría de Inhibición del crecimiento radial de las cuatro aislamientos de Colletotrichum spp. por efecto de las cepas de Trichoderma spp. 61 Anexo 6. Categoría de Inhibición del crecimiento radial de las cuatro aislamientos de Fusarium spp. por efecto de las cepas de Trichoderma spp. 62 Anexo 7. Aislamiento de hongos fitopatógenos a partir del tejido vegetal con síntomas de la enfermedad. 63 Anexo 8. Aislamiento de hongos fitopatógenos por punción de tejido vegetal con signos de la enfermedad. 64 Anexo 9. Procedimiento para el aislamiento de Trichoderma sp., a partir de suelo. 65 Anexo 10. Procedimiento de obtención de Trichoderma y fitopatógenos en tapete y block de gelosa. 66 Anexo 11. Característica observada en los tratamientos (Trichoderma sp. X Colletotrichum sp.) al 4to día de enfrentamiento. 67 Anexo 12. Característica observada en los tratamientos (Trichoderma sp. X Colletotrichum sp.) al 8vo día de enfrentamiento. 68 Anexo 13. Característica observada en los tratamientos (Trichoderma sp. X Fusarium sp.) al 4to día de enfrentamiento. 69 Anexo 14. Característica observada en los tratamientos (Trichoderma sp. X Fusarium sp.) al 8vo día de enfrentamiento. 70 Anexo 15. Cepas de Trichoderma spp., crecimiento en tapete. 71 Anexo 16. Cepas de Trichoderma spp., aisladas de suelo. 72 Anexo 17. Trichoderma sp. cepa T-7 frente a Fusarium sp. cepa F-1, al 4to día de enfrentamiento. 73 Anexo 18. Trichoderma sp. cepa T-4,1 frente a Fusarium sp. cepa F-3, al xiv 4to día de enfrentamiento. 74 Anexo 19. Micoparasitismo grado de antagonismo 4 según la escala de Elías y Arcos, Trichoderma sp. cepa T-4.2 frente a Colletotrichum spp.; comparación con su blanco. 75 Anexo 20. Micoparasitismo grado de antagonismo 4 según la escala de Elías y Arcos, Trichoderma sp. cepa T-3 frente a Colletotrichum spp.; comparación con su blanco. 76 Anexo 21. Micoparasitismo grado de antagonismo 0 según la escala de Elías y Arcos, Trichoderma no logra invadir a Colletotrichum spp. 77 Anexo 22. Enfrentamiento dual de Trichoderma spp. frente a Fusarium spp. a los 7 días de enfrentamiento. 78 Anexo 23. Micoparasitismo grado 0 de Trichoderma sp. cepa comercial (Th-1) frente a Fusarium sp. cepa F-1. 79 Anexo 24. Micoparasitismo grado 0 de Trichoderma sp. cepa T4.1 frente a Fusarium cepa F2. 80 Anexo 25. Procedimiento de recolección de muestra. 81 Anexo 26. Matriz de consistencia. 82 xv RESUMEN El trabajo de investigación cuyo objetivo fue evaluar el efecto antagónico de Trichoderma sp., frente a los fitopatógenos Colletotrichum sp. y Fusarium sp., se realizó en el laboratorio de Microbiología Ambiental, 2018. El Tipo de investigación fue básica experimental, con diseño completamente al azar de un solo factor. Se establecieron 7 tratamientos para cada una de las cepas de fitopatógenos Colletotrichum spp. y Fusarium spp., con 3 repeticiones. El material biológico estuvo conformada por 7 cepas nativas de Trichoderma spp., aisladas de la rizósfera de arveja y papa, 4 cepas de Colletotrichum spp. y 4 cepas de Fusarium spp. Para el efecto antagónico se aplicó la técnica de cultivo dual, como instrumento para determinar el porcentaje de inhibición radial (PIRC) y micoparasitismo. Al evaluar el PIRC para Trichoderma spp. frente a las cepas de Colletotrichum spp. todas las cepas nativas de Trichoderma spp., alcanzaron un porcentaje de inhibición de 26,32 a 45%, las cuales se ubican en la categoría 2; En cambio, frente a Fusarium spp., las cepas nativas de Trichoderma spp. alcanzaron un porcentaje de inhibición que va de 28,57 a 61,11%, las cuales se ubicaron en las categorías 2 y 3. Al medir el micoparasitismo de Trichoderma spp., sobre Colletotrichum spp., los mejores resultados obtuvieron las cepas nativas de Trichoderma T-2, T-3 y T-4,2 ubicándose dentro de la escala de capacidad antagónica con grado 4 y potencial de muy bueno, sin embargo estas cepas tuvieron un PIRC con categoría 2; el micoparasitismo de cepas nativas de Trichoderma spp. frente a Fusarium spp., las cepas nativas de Trichoderma T-1, T-2, T-3, T-4,1, T-4,2 y T-5, obtuvieron el grado 4 frente a las colonias nativas de Fusarium sp. F-1 y F-4. Palabras clave: Efecto antagónico, micoparasitismo. xvi 1 I. INTRODUCCIÓN La investigación desarrollada se refiere a la evaluación del efecto antagónico de Trichoderma sp. frente a los hongos fitopatógenos Colletotrichum sp. y Fusarium sp. Una estrategia es el uso de microorganismos antagónicos, siendo Trichoderma el género más estudiado como antagonista; utilizar a Trichoderma como alternativa para el control biológico de diversos fitopatógenos; especialmente para Colletotrichum y Fusarium como una alternativa de control inocuo y efectivo, así reducir el uso de fungicidas agrícolas; el control biológico de hongos fitopatógenos con Trichoderma permite obtener alimentos inocuos, lo cual evita el rechazo en los mercados internacionales que cada día son más demandantes de productos libres de plaguicidas sintéticos1. Actualmente en nuestro medio así como en la agricultura mundial los hongos fitopatógenos son causantes de enfermedades, siendo responsables de importantes pérdidas económicas, el uso de fungicidas y plaguicidas para eliminar fitopatógenos han traído como consecuencia severos problemas de contaminación al medio ambiente, ha generado resistencia de plagas y enfermedades, así como la presencia de nuevas especies de fitopatógenos con un grado de afectación más virulento2. Colletotrichum comprende más de 100 especies responsables de causar antracnosis en plantas y frutos de importancia económica, causando pérdidas de hasta 75% en los cultivos3. La antracnosis en arveja se presenta en hojas y vaina, produciendo manchas redondeadas de color amarillo con bordes que se oscurecen con el tiempo; en cambio en el rocoto se presenta en el fruto con hundimiento del tejido vegetal y estructuras fúngicas de color naranja. Fusarium es otro hongo de importancia agrícola, tiene también distribución a nivel mundial y afecta a más de 80 cultivos de importancia económica4. La 2 pudrición seca es una enfermedad causada por Fusarium sp. donde el tubérculo se pudre, endurece y se momifica. La investigación de esta problemática se realizó con el interés de conocer el efecto antagónico in vitro de cepas nativas de Trichoderma sp. frente a los hongos fitopatógenos Colletotrichum sp. y Fusarium sp. por el método de cultivo dual para determinar el porcentaje de inhibición radial de crecimiento (PIRC), por otro lado también se determinó el grado de antagonismo (micoparasitismo), la aplicación de técnicas y procedimientos en este proceso servirán como base para posteriores investigaciones. El informe final de la presente investigación consta de las siguientes partes: índice, introducción, marco teórico, materiales y métodos, resultados, discusión, conclusiones, recomendaciones, referencia bibliográfica y anexos. En el presente trabajo de investigación se plantearon los siguientes objetivos: Objetivo general Evaluar el efecto antagónico in vitro de cepas nativas de Trichoderma sp. frente a los hongos fitopatógenos Colletotrichum sp. y Fusarium sp. Objetivos específicos  Determinar el porcentaje de inhibición de Trichoderma sp. sobre Colletotrichum sp.  Determinar el porcentaje de inhibición de Trichoderma sp. sobre Fusarium sp.  Determinar el grado de antagonismo (micoparasitismo) de Trichoderma sp. sobre Colletotrichum sp. y Fusarium sp. 3 II. MARCO TEÓRICO 2.1. Antecedentes 2.1.1. A nivel internacional Ramírez, J. y col.5 en Colombia, en su trabajo de investigación evaluaron el antagonismo in vitro de dos cepas nativas de Trichoderma asperellum (GRB- HA1 y GRB-HA2) contra Colletotrichum gloeosporioides, Curvularia lunata, y Fusarium oxysporum, arribaron a las siguientes conclusiones: ambos aislamientos de Trichoderma asperellum resultaron en 100 % en porcentaje de inhibición radial de crecimiento (PIRC), y micoparasitismo de grado 4 en cultivos duales contra Colletotrichum gloeosporioides. T. asperellum GRB-HA1 condujo a 70 % de PIRC y grado 3, y T. asperellum GRB-HA2 condujo a 84 % de PIRC y grado 4 de micoparasitismo contra F. oxysporum. Arbito, M.6 en Ecuador, evaluó la capacidad antagónica in vitro de 4 cepas de Trichoderma spp. (M2, M3, M4 Y M5) frente a Fusarium spp., concluyó: Trichoderma spp. (M2, M3, M4 Y M5) presentaron un porcentaje de inhibición de crecimiento radial de (PICR) sobre Fusarium spp. entre el 50 y 67%. La cepa que mayor PICR presento, corresponde a Fusarium, la cepa M2 (65,19%), mientras que la menor PICR M5 (52,29%). Díaz E.7 en Ecuador, investigó la eficacia del uso de Trichoderma spp. como método de control biológico de Fusarium spp. en cultivo de clavel mediante el método dual, concluye que: T. harzianum produjo porcentajes de inhibición del 26,9% para F. oxysporum. García L.8 en Colombia, en su trabajo de investigación “Evaluación Del Antagonismo de Cepas de Trichoderma spp. frente a Cepas de Fusarium spp. Y Colletotrichum spp. aisladas de Cultivos Orgánicos de Sábila (Aloe vera) Y Arándano (Vaccinium corymbosum)”, llegó a los siguientes resultados: el porcentaje de inhibición radial de Trichoderma spp., sobre el crecimiento de 4 Fusarium spp., fue de 72% y contra Colletotrichum spp., fue de 59%, el autor considero como buenos, puesto que para que un producto sea considerado como biocontrolador efectivo, debe arrojar al menos 60% de inhibición en la técnica de enfrentamiento dual en laboratorio. Vargas, H. y Gilchrist, E.9 en Colombia, determinaron la capacidad antagónica de la cepa de Trichoderma asperellum (T109) contra dos cepas nativas del hongo fitopatógeno Fusarium sp. (M2Raíz, M3Tallo); Concluyeron: la cepa Trichoderma asperellum (T109) presento buena capacidad antagónica contra ambos aislamientos fitopatógenos, ya que se observó disminución en su capacidad de crecimiento del 60% y 40% Fusarium sp. M2Raíz y Fusarium sp. M3Tallo, respectivamente. Martínez, A.10 en Ecuador, evaluó la capacidad antagónica de las cepas nativas de Trichoderma sp. para control biológico de Fusarium sp. en maracuyá, arribó a los siguiente resultados: Trichoderma sp. presentan alta capacidad para inhibir el crecimiento radial del patógeno, obtuvo inhibiciones de crecimiento del patógeno Fusarium solani en porcentajes que van desde 69,7% a 72,35%. Rudy, N. col.11 en La paz, Bolivia, en su investigación comprobaron el control del hongo antagónico Trichoderma sp. sobre los hongos fitopatógenos Rhizoctonia sp. y Fusarium sp. en café (Coffea arabica). Donde concluyeron: el porcentaje de inhibición de crecimiento de Trichoderma sp. en Fusarium sp. fue de un 37%. Michel A. y col.12 en México, evaluaron el efecto antagónico in vitro de cepas nativas de Trichoderma spp. sobre Fusarium subglutinans y Fusarium oxysporum, agentes causales de la “escoba de bruja” del mango, los cuales concluyeron con que las cepas nativas de Trichoderma spp. presentaron los mayores porcentajes de antagonismo contra ambos fitopatógenos, al inhibir el crecimiento micelial en 62,9% de F. oxysporum y 42,0% de F. solani. 2.1.2. A nivel nacional Llicahua, D.13 en Arequipa, aisló y determino el efecto antagonista “in vitro” de Trichoderma spp. frente a Fusarium sp. del cultivo de cebolla de los distritos de Santa Rita de Siguas y de Tiabaya– Arequipa-2018, donde llego a los siguientes resultados: la capacidad antagónica de las cepas de Trichoderma TSS-1 y TST-1 fue alta (grado 4), seguido de las cepas TES-1 y TET-1 (grado 1); El PICR evaluado fue altamente efectivo para la cepa de Trichoderma TSS-1 con 97,4% y efectivo para las cepas de Trichoderma TST-1 con 90,8%, TES-1 con 86,5% y TET-1 con 76,3%. 5 Goñas, M. y col.14 en Amazonas, evaluaron el efecto in vitro de cuatro controladores biológicos (Trichoderma harzianum, T. viride, T. asperellum y Clonostachys rosea) frente a los hongos patógenos Colletotrichum spp. y Botrytis spp. al comparar los resultados, las cepas de Trichoderma spp. presentaron mayor PIRC sobre Colletotrichum spp.; T. asperellum ( 69,4%), T. harzianum (68,7%) y T. viride (67,1%) Flores, w.15 en Trujillo, en su trabajo de investigación “control biológico in vitro de Colletotrichum gloeosporioides causante de la antracnosis frente a Clonostachys rosea, Fusarium oxysporum y Trichoderma harzianum.” Concluye lo siguiente: mejor controlador biológico de C. gloeosporioides fue T. harzianum el mayor porcentaje de inhibición del crecimiento de un 65,12% a 30°C en PDA. Vargas, R.16 en Arequipa, en su trabajo de investigación “Antagonismo de Trichoderma koningiopsis y Trichoderma harzianum sobre Fusarium oxysporum f. sp. cepae y Phoma terrestris in vitro”; observó en sus resultados una inhibición del crecimiento radial de Fusarium oxysporum f. sp. cepae por T. harzianum de 83,40%, T. koningiopsis con 77,45%. En cuanto al grado de micoparasitismo T. harzianum y T. koningiopsis mostraron un micoparasitismo grado 4 frente a Fusarium oxysporum f. sp. cepae. Torres, S.17 en Trujillo, evaluó el efecto “in vitro” de tres especies nativas de Trichoderma sobre la germinación y crecimiento de Colletotrichum acutatum; en el que concluye, que Trichoderma harzianum y Trichoderma viride las que presentan mayor efecto sobre C. acutatum. 2.2. Marco conceptual 2.2.1. Antagonismo Es una interacción entre microorganismos donde uno interfiere con el crecimiento del otro, es decir causa la pérdida o la actividad de uno de ellos. Esta es la base sobre la que se sustenta el verdadero control biológico de microorganismos fitopatógenos en las plantas18. a) Microorganismos antagonistas Varios tipos de microorganismos se han descrito como agentes de control biológico de enfermedades en cultivos. Prácticamente todas las plagas y enfermedades son afectadas en alguna medida por organismos antagonistas. En muchos casos estos entes biológicos representan el factor más importante en la regulación de las poblaciones de microorganismos fitopatógenos en la naturaleza18. 6 Entre los microorganismos más importantes se encuentran las bacterias de los géneros Pseudomonas y Bacillus y hongos de los géneros Gliocladium y Trichoderma. Este último es el más utilizado para el control de un grupo importante de patógenos del suelo19. b) Mecanismos de acción Se han descrito varios mecanismos de acción de los antagonistas para controlar el desarrollo de patógenos. Algunos de estos son antibiosis, competencia por espacio o nutrientes, interacciones directas con el patógeno (micoparasitismo y lisis enzimática) e inducción de resistencia19. No es fácil determinar con precisión los mecanismos que intervienen en las interacciones entre los antagonistas y los patógenos en la planta. En general, los antagonistas no tienen un único modo de acción y la multiplicidad de estos es una característica importante para su selección como agentes de control biológico. Si el antagonista posee varios modos de acción reduce los riesgos de desarrollo de resistencia en el patógeno 19. c) Efecto antagónico Se entiende por efecto antagónico al mecanismo que se basa en la actividad inhibitoria directa que ejerce un microorganismo sobre otro. 2.2.2. Trichoderma El género Trichoderma se caracterizan por ser hongos saprófitos, que sobreviven en suelos con diferentes cantidades de materia orgánica, los cuales son capaces de descomponerla y en determinadas condiciones pueden ser anaerobios facultativos, lo que les permite mostrar una mayor plasticidad ecológica. Las especies de Trichoderma se encuentran presentes en todas las altitudes, desde las zonas polares hasta la ecuatorial20. El género Trichoderma fue descrito por Persoon en 1794. Posteriormente, Rifai20 hizo el primer agrupamiento en especies agregadas que se utiliza hasta el presente, a pesar de las dificultades que se presentan para la identificación de especies por este método, debido a la cercanía morfológica y la evolución de las mismas. Son hongos saprofitos del suelo y la madera, de crecimiento muy rápido22. Las especies de este género se encuentran ampliamente distribuidas por todas las latitudes, y se presentan naturalmente en diferentes ambientes, especialmente en aquellos que contienen materia orgánica o desechos vegetales en descomposición21. 7 Rifai en 1969 investigó al género Trichoderma y propuso nueve especies agregadas: Trichoderma piluliferum Webster & Rifai, Trichoderma polysporum (Link ex Pers) Rifai, Trichoderma hamatum (Bon) Bain, Trichoderma koningii Rifai, Trichoderma aureoviride Rifai, Trichoderma harzianum Rifai, Trichoderma longibrachiatum Rifai, Trichoderma pseudokoningii Rifai y Trichoderma viride Pers ex S. F Gray. Estas especies se identificaron teniendo en cuenta diferencias morfológicas y fisiológicas, como: tipo de ramificación del conidióforo, forma del conidio, crecimiento y coloración de la colonia, entre otras21. a) Taxonomía Trichoderma actualmente se encuentra en la siguiente clasificación taxonómica23 Reino : Fungi División : Eumycota Subdivisión : Ascomycotina Clase : Euascomycetes Orden : Hypocreales Familia : Hypocraceae Género : Trichoderma Especie : Trichoderma sp. Se reproducen mediante conidios, debido a su gran capacidad reproductiva, su crecimiento se ve favorecido por la presencia de materia orgánica y humedad, son tolerantes de condicione extremas como temperatura, pH y salinidad24. b) Características de Trichoderma  Características macroscópicas Las colonias de Trichoderma son de rápido crecimiento en medio APD (Agar Papa Dextrosa), inicia con la formación de una callosidad en la muestra sembrada, creciendo el primer día un promedio de 12,68 mm de diámetro con la formación de un anillo hialino, el segundo día presenta una capa blanca esponjosa en el anillo que al tercer día se torna verde25, al quinto o sexto día la colonia toma una coloración verde-oscura de aspecto polvoriento6; al observar el envés del medio de cultivo las colonias son de color amarillo, ámbar o amarillo verdoso26.  Características microscópicas El género Trichoderma en su estado vegetativo presenta micelio con septos simples. Las especies son haploides y su pared está compuesta por quitina y glucano27. 8 Conidióforos: son hialinos, erectos, no verticilados, generalmente ramificados, pueden estar en solitario o agrupados26. Fiálides: en esta estructura se forman los conidios (esporas asexuales). Presentan una forma de botella, están solas o agrupadas, son hinchadas en la región central pero alargada en sus terminaciones26. Conidios: son esporas asexuales de coloración verde, amarillo o blanco; con esporulación densa para asegurar la supervivencia, dispersión y reproducción del hongo. Las paredes de los conidios están compuestas por quitina y glucagón24. Clamidosporas: presentan una coloración a marillenta o verdosa, un olor a humedad, una forma elíptica o globosa, estas estructuras son comunes en las especies de genero trichoderma, su diámetro es de 6-15 µm en la mayoría de especies 25. Estas estructuras son de vital importancia para la sobrevivencia del género en el suelo bajo condiciones adversas. c) Condiciones de crecimiento de Trichoderma Condiciones para un buen crecimiento:  Temperatura Varía de 15°C – 35°C, siendo 25°C la temperatura óptima.  Humedad relativa Trichoderma se desarrolla entre 20% y 80% de humedad, siendo lo óptimo 70%.  pH Se desarrollan mejor a pH de 6 – 6,5, y resisten a mayores valores debido a la secreción de ácidos orgánicos que acidifican el medio.  Carbono Siendo la principal fuente de este elemento la celulosa28. d) Capacidad antagónica de Trichoderma La capacidad antagónica de Trichoderma es variable y depende de la especificidad de la cepa y de su modo de acción, las cepas nativas son más eficaces que las importadas. Dentro de los mecanismos responsables de su capacidad antagónica está la antibiosis, competencia, micoparasitismo, desactivación de enzimas de patógenos y otros27.  Competencia La presencia de Trichoderma en suelos agrícolas y naturales en todo el mundo es una evidencia, de que es un excelente competidor por espacio y recursos 9 nutricionales. La competencia por nutrientes de Trichoderma, es principalmente por carbono, nitrato y hierro29.De forma general, entre las cualidades que favorecen la competencia de este antagonista se encuentra, la alta velocidad de crecimiento que posee gran parte de sus aislamientos y la secreción de metabolitos de diferente naturaleza, que frenan o eliminan a los competidores en el microambiente. Este modo de acción influye en “bloquear el paso” al patógeno y resulta importante para la diseminación del antagonista27. La competencia evaluada bajo condiciones in vitro (cultivo dual), se ejerce principalmente por espacio y en ella intervienen la velocidad de crecimiento de las cepas del antagonista y factores externos como tipo de sustrato, pH y temperatura, entre otros27.  Micoparasitismo Este es un proceso complejo en la interacción antagonista-patógeno, que ocurre en cuatro etapas30. Crecimiento quimiotrófico donde Trichoderma puede detectar a distancia a sus posibles hospedantes31, Reconocimiento: Se considera que existe una alta especificidad del antagonista por su sustrato32, Adhesión y enrollamiento: Ocurre por la asociación de un azúcar de la pared del antagonista con una lectina presente en la pared del patógeno33 y. Actividad lítica: Producción de enzimas líticas extracelulares, fundamentalmente quitinasas, glucanasas y proteasas, que degradan las paredes celulares del patógeno y posibilitan la penetración de las hifas de Trichoderma34. El micoparasitismo concluye con la pérdida del contenido citoplasmático de la célula hospedante, mostrando síntomas de disgregación35. Diferentes interacciones hifales están involucradas en el micoparasitismo, tales como: enrollamiento, penetración, vacuolización, granulación, coagulación, desintegración y lisis36. En el parasitismo a nivel microscópico no todas estas interacciones son siempre observadas, pues al parecer dependen del aislamiento de Trichoderma, del patógeno y de las condiciones del ambiente27. Las enzimas desempeñan una función esencial en el micoparasitismo, ya que la penetración de la hifa de Trichoderma en su hospedante está regida por la maquinaria enzimática de este antagonista, y depende más del aislamiento y del hospedante, que de la propia especie del biorregulador27. 10 El crecimiento de Trichoderma sobre el patógeno en cultivo dual, no es garantía de alta capacidad parasítica, ya que las hifas de ambos pueden compartir espacios en el sustrato sin llegar a parasitarlo27.  Antibiosis Los metabolitos con actividad antifúngica secretados por Trichoderma constituyen un grupo de compuestos volátiles y no volátiles, muy diverso en cuanto a estructura y función. Muchas cepas de Trichoderma producen estos metabolitos secundarios, algunos de los cuales inhiben otros microorganismos, con los que no se establece contacto físico, y estas sustancias inhibitorias fueron consideradas “antibióticos”37-38. Se identificaron compuestos del tipo de las alquil-pironas (6-a-pentil-pirona), isonitrilos (isonitrina), poliquétidos (harzianolida), peptabioles (trichodermina, atroviridina, alameticina, suzucacilina y trichozianina), dicetopiperacinas (gliovirina y gliotoxina), sesquiterpenos (ácido heptelídico) y esteroides (viridina)30-39. Las diversas especies de Trichoderma tienen capacidad antagónica contra diversos hongos fitopatógenos, como Rhizotonia solani, Fusarium oxysporum, Sclerotinia sclerotiorum, Colletotrichum gloesporioides, Sclerotium rolfsii, Botrytis cinére40. 2.2.3. Colletotrichum Colletotrichum es un género de hongos fitopatógenos que ocasiona enfermedades como cánceres, pudriciones y principalmente antracnosis en diferentes hospedantes; se manifiesta en lesiones semicirculares con hundimientos en forma de anillos concéntricos41. A nivel mundial se reporta la antracnosis en frutas, hortalizas, cereales, plantas herbáceas, maderables y ornamentales, entre otras; sobre todo en zonas templadas y tropicales42. a) Taxonomía de Colletotrichum Phyllum : Ascomycota, Clase : Hypocreomycetidae, Orden : Glomerellales, Familia : Glomerellaceae Género : Colletotrichum Especie : Colletotrichum sp43. 11 b) Características de Colletotrichum  Características macroscópicas En su morfología a nivel macroscópico in vitro en medio APD se evidencia colonias aterciopeladas, de vez en cuando granulosas, de crecimiento lento, y cambios en la coloración después de llevar a cabo la reproducción, en este momento se inicia la etapa de senescencia que induce coloraciones más oscuras, otra ligera diferencia en la coloración se da por el medio de cultivo44-45.  Características microscópicas A nivel microscópico, se encuentran estructuras asexuales como conidios hialinos, curvados y fusiformes y un acérvulo setoso, con crecimientos de 90º en hifas septadas, conidios simples sin septos, alargados y ovoides46, de forma cilíndrica con ambos lados rectos y extremos redondos47. c) Colletotrichum Como fitopatógeno Colletotrichum es un hongo de distribución cosmopolita y con predominancia en las regiones tropicales y subtropicales48. Comprende principalmente patógenos de plantas y frutos, incluye a más de 100 especies responsables de causar la antracnosis, por tal motivo es esencial identificar las especies para mejorar el control de la enfermedad49.  Fitopatógeno de importancia económica El hongo Colletotrichum afectan a los cultivos de alta importancia económica ocasionando pérdidas de hasta el 75 % en diversos cultivos; algunos frutales afectados son: el mango (Mangifera indica L.), el aguacate (Persea americana Mill.), el tomate de árbol (Cyphomandra betacea Cav.), la papaya (Carica papaya L.), la mora (Rubus glaucus Benth), el lulo (Solanum quitoense Lam.), la guanábana (Annona muricata L.), la fresa (Fragaria x ananassa Duch.), la sandía (Citrullus lanatus Thunb.), el melón (Cucumis melo L.), el plátano (Musa spp.), la guayaba (Psidium guajava L.), el maracuyá (Passiflora edulis Sims) y los cítricos (Citrus spp.) y otros cultivos que se ven afectados son: el fríjol (Phaseolus vulgaris L.), la soya (Glycine max L. Merr.), el sorgo (Sorghum bicolor L. Moench), la alfalfa (Medicago sativa L.), el ñame (Dioscorea spp.), la yuca (Manihot esculenta Crantz), el pimentón (Capsicum annum L.), el café (Coffea arabica L.), y algunos cereales, leguminosas, pastos y cultivos perennes50-51.  Patogenicidad y virulencia Es un hongo que a nivel mundial presenta un amplio rango de plantas hospederas, se manifiesta como saprófito o fitopatógeno de alta incidencia en 12 cultivos de varias especies y familias, presentando problemas no sólo en cultivo y en cosecha sino también en poscosecha.52 relaciona que la incidencia de la enfermedad varía marcadamente de acuerdo a la susceptibilidad varietal, las condiciones climáticas y la virulencia del patógeno 53. Velastegui et al.54 demuestra que Colletotrichum sp. no sólo se encuentra en épocas húmedas, también en época seca mostrando incidencias más bajas, lo que evidencia que esta enfermedad es constante, desarrollando ciclos más largos en estas épocas, pero continuando con la diseminación y contaminación de la enfermedad a las plantas en épocas secas. Las especies de este género son consideradas como las más exitosas dentro de los hongos patógenos gracias a su potencial para producir infecciones latentes, con mayor frecuencia en zonas templadas y tropicales52-55.  Fases de nutrición en la colonización Las especies de Colletotrichum sp. se desarrollan en dos fases principales de nutrición, durante la colonización de la planta: La fase inicial biotrófica es corta y asegura el crecimiento de la planta gracias a la falta de reconocimiento del patógeno, obteniendo alimento de las células vivas y asegurando la colonización en él56. La segunda fase tardía necrótrofa, inicia la aparición de síntomas específicos del hongo, con el incremento de la actividad enzimática y por consiguiente la degradación de la pared celular en el tejido, en esta fase la alimentación la obtiene de las células muertas56.  Antracnosis en fruto La antracnosis es una enfermedad que pueden provocar pérdidas importantes en el rendimiento y la calidad de los cultivos. Disminuyendo la vida útil de las plantas y limitando su producción y comercialización, causando grandes pérdidas económicas57. Pueden ser causados por varios hongos, uno de los cuales es el género Colletotrichum (Colletotrichum capsici, C. gloeosporioides, C. coccodes, etc.), La antracnosis en la arveja (Colletotrichum pisi) se presenta en las hojas y vainas, produciendo manchas redondeadas de unos 5 mm de diámetro de color amarillo con los bordes más oscuros58. La antracnosis en el rocoto se presenta en frutos, sin embargo también pueden producirse en hojas y tallos cuando se dan condiciones óptimas. Cuando el fruto madura la susceptibilidad a esta enfermedad aumenta; producen las lesiones circulares con masa de esporas de color naranja59. 13 2.2.4. Fusarium El género Fusarium es un grupo de hongos filamentosos ampliamente distribuidos en el suelo y plantas. Con gran importancia económica ya que son habituales fitopatógeno. Poseen un micelio altamente desarrollado, septado y con conidióforos característicos del género, algunas especies presentan el talo unicelular60. a) Taxonomía de Fusarium La clasificación del genero Fusarium ha sufrido modificaciones desde las primeras descripciones hechas por Link en 1803; debido a la aparición de nuevas tecnologías utilizadas actualmente, sin embargo en la mayoría de los estudios se mantiene vigente la taxonomía basada en el reconocimiento de su estructura morfológica61. De acuerdo a Groenewald62 y Díaz de Castro, et al63. Reino : Fungi División : Ascomycota Clase : Euascomycetes Orden : Hypocreales Familia : Hypocreaceae Género : Fusarium Especie : Fusarium sp. Los hongos del género Fusarium son cosmopolitas y muy abundantes en las zonas tropicales y templadas del mundo. Es una de las más importantes especies fitopatógeno, debido a las pérdidas económicas que causa en los cultivos comerciales. Está entre las especies más abundantes, cosmopolitas y complejas pues tiene más de 100 formas especiales caracterizadas por su alta especificidad en las plantas hospedantes que afecta64. b) Características de Fusarium  Características macroscópicas Fusarium se caracteriza por producir colonias de crecimiento rápido y abundante, generalmente de aspecto algodonoso, de diversos colores que van del blanco, rosado, salmón o violeta cubriendo toda la superficie del medio65. El medio APD (Agar Papa Dextrosa) garantiza el crecimiento, pero no la esporulación.  Características microscópicas El hongo produce tres clases de esporas: 14 1. Microconidias: esporas generalmente unicelulares, sin septas, hilianas, elipsoidales a cilíndricas, rectas o curvas; se formaron sobre fiàlides laterales, cortas, simples o sobre conidióforos poco ramificados. Las microconidias tienen 5-12 μm de largo por 2,5-3,5 μm de ancho66. 2. Macroconidias: esporas de paredes delgadas, fusiformes, largas, moderadamente curvadas en forma de hoz, con varias células y de 3 a 5 septas transversales, con la célula basal elongada y la célula apical atenuada; las macroconidias tiene un tamaño de 27 a 46 μm de largo por 3,0 a 4,5 μm de ancho66. 3. Clamidosporas: esporas formadas a partir de la condensación del contenido de las hifas y de las conidios, de paredes gruesas. Se forman simples o en pares, terminales o intercalares: poseen un tamaño de 5 a 15 μm de diámetro66. Gracias a ellas el hongo sobrevive en condiciones ambientales desfavorables y en el suelo como saprófito de vida libre en ausencia de plantas hospedantes67. c) Fusarium como fitopatógeno: Fusarium se comporta como fitopatógeno al encontrar en la planta las características apropiadas y necesarias para crecer. Este penetra las diferentes capas de la corteza de la raíz a través de heridas o directamente, hasta alcanzar el sistema vascular68. Una vez establecido, la colonización de la planta es llevada a cabo rápidamente a través del xilema, que conlleva a la sintomatología característica de la marchitez. Por ejemplo, F. oxysporum es capaz de invadir el sistema vascular de la planta produciendo unas 14 variedades de enzimas líticas que despolimerizan todos los componentes de la pared celular del vegetal, como son: el xilano, la celulosa, las pectinas y proteínas como las extensinas69. Este hongo tiene la capacidad de sobrevivir por largos periodos en el suelo, debido a sus estructuras de resistencia denominadas clamidosporas, lo que vuelve inefectiva la rotación de cultivos a corto plazo70-71.  Fitopatógeno de importancia económica El género Fusarium es un patógeno distribuido ampliamente a nivel mundial (en más 32 países) y afecta a más de 80 cultivos de importancia comercial, como el tomate y la cebolla4. Existen diversas especies del género Fusarium, sin embargo las más relevantes para los cultivos de hortalizas son Fusarium oxysporum y Fusarium solani. 15 d) Metabolitos tóxicos de Fusarium A parte de inactivar las sustancias toxicas producidas por hospedero como mecanismo de defensa, Fusarium crea sus propias toxinas que aumentan su patogenecidad. Entre estas toxinas esta las fitotoxinas como las eniatinas y ácido furasico; mientras que para los animales son las micotoxinas, tricotenos y fumonisinas. Los contaminantes frecuentes de los cereales son los tricotecenos y las fumonisinas61. e) Principales especies patógenos del genero Fusarium Los más relevantes se agrupan en: Fusarium graminearum: comprende las especies que ocasionan la fusariosis de la espiga en cebada, trigo y arroz, contaminando la espiga con micotoxinas tricoteceno72. Fusarium oxysporum: sus especies son responsables del marchitamiento vascular de más de 100 especies vegetales de importancia económica y alimenticia como el tomate, platano, espárragos, etc72. Fusarium solani, estas especies producen la podredumbre del pie y la raíz de diversos vegetales72. Fusarium fujikuroi, abarca el mayor número de especies, se le asocia con diversas enfermedades como la enfermedad de bakanae en arroz, podredumbre del maíz, chancro en el pino; son muy conocidos por contaminar los diferentes cultivos con la micotoxina fumonisina72. f) Pudrición seca de la papa La pudrición seca de la papa es una de las enfermedad de la post cosecha que ataca tubérculos almacenados, es causado por Fusarium sp., los cuales provienen de los mismos campos de cultivo en sus diversas formas ya sea como estructuras de propagación (conidias, micelios) o de conservación (clamidosporas) que pueden estar presentes en la superficie del tubérculo. Pueden causar pudrición total o parcial de los tubérculos73. 2.2.5. Técnica de enfrentamiento dual La prueba de enfrentamiento dual, es una prueba en la que se observa las características de: crecimiento, adaptación y capacidad biocontroladora – defensa, tanto del hongo patógeno como del antagonista. Consiste en el enfrentamiento del patógeno y el antagonista en una placa de Petri. Para logra determinar el grado de antagonismo y porcentaje de inhibición de crecimiento radial74. 16 2.2.6. Cepas nativas Son cepas exclusivamente de una microorganismo específica o autóctona por lo que no presentan ningún tipo de modificación inducida por el hombre; se encuentran en un estado similar al que presentan las cepas silvestres. 17 III. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Ubicación 3.1.1. Ubicación del lugar de muestreo Departamento : Ayacucho Provincia : Huamanga Distrito : Ayacucho Zona : Mollepata 3.1.2. Lugar de ejecución La presente investigación se llevó a cabo en los laboratorios de Microbiología Ambiental de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de San Cristóbal de Huamanga, Distrito Ayacucho, Provincia Huamanga del Departamento de Ayacucho. 3.2. Materiales 3.2.1. Material biológico  7 cepas nativas de Trichoderma sp.  4 cepas de Colletotrichum sp.  4 cepas de Fusarium sp. 3.3. Diseño metodológico 3.3.1. Recolección de muestras a) Recolección de muestras de suelo Se tomaron muestras de suelos rizosférico de cultivos de arveja y papa aproximadamente 500g. Se retiró la capa superior de suelo con ayuda de una pala y un pico, se escarbó una profundidad aproximada de 20 cm, con una cuchara estéril se recogió las muestras de suelo y se colocaron en bolsas de polietileno estéril, previamente rotuladas con los datos y se transportaron al laboratorio de Microbiología Ambiental para su procesamiento8-12. 18 b) Recolección de muestras de material vegetal Se recolectaron arveja, rocoto con signos y síntomas de la enfermedad, (antracnosis) y papa (pudrición seca); cada vegetal fue envuelto en papel Kraft de manera independiente, los que se colocaron en bolsas de polietileno estéril70, se trasladaron en cajas de cartón al laboratorio de Microbiología Ambiental. 3.3.2. Aislamiento de cepas antagonistas y fitopatógenos a) Aislamiento de las cepas de nativas de Trichoderma sp75. A partir de las muestras de suelo recolectadas y se realizó una dilución pesando 1 g de muestra de suelo en 99 mL de agua destilada estéril, de esta se tomaron 0,2 mL y se sembró por diseminación en medio APD + Cloranfenicol (para evitar crecimiento de bacterias), se incubó a 25°C por 4 días. Luego de este tiempo se observaron las características macroscópicas y microscópicas de las colonias. Para el estudio microscópico se utilizó la técnica del cinta adhesiva (cinta Scotch), tomando las estructuras fúngicas de las colonias y coloreando con azul de Lactofenol los que se observaron al microscopio con el objetivo de 40X; para evaluar la forma de las esporas. b) Aislamiento de cepas de fitopatógenos Colletotrichum sp. y Fusarium sp.  Técnica a: Aislamiento a partir de estructuras que se encuentran en la superficie del vegetal (signos) 76 De las muestras de arveja, rocoto con presencia fúngica (signos) y síntoma (antracnosis) y papa (pudrición seca), se realizaron siembras directas sobre la placa con medio APD; con la ayuda del asa de kolle en gancho se tomó una pequeña porción de la estructura fúngica del hongo y se sembró por puntura sobre el medio APD + Cloranfenicol y se incubo a 25°C por 5 a 7 días. Luego de este tiempo se observaron las características culturales de las colonias y características microscópicas.  Técnica b: Aislamiento del hongo con síntomas de la enfermedad76 A partir de los vegetales arveja y rocoto con síntomas (antracnosis) y pudrición seca en papa, se cortaron el material vegetal, conteniendo una parte del tejido sano y enfermo, en pequeños trozos. Estos trozos se colocaron en solución de hipoclorito de sodio al 2% por 2 minutos, luego se enjuago con agua destilada estéril 5 veces y se secó con papel filtro, se tomaron los trozos con la ayuda de una pinza desinfectada y se sembró en la superficie del medio APD + Cloranfenicol, distribuyéndolos equidistantemente, en cuatro puntos.Se incubo a 19 25°C por 5 a 7 días. Luego del periodo de incubación se observaron las características macroscópicas y microscópicas de las colonias. 3.3.3. Identificación por microcultivo77 Previamente se esterilizaron el equipo de microcultivo. Se cortaron de la placa con medio de APD con hoja de bisturí, cuadraditos de agar de 0,5 centímetros. Con la espátula o la hoja de bisturí se colocó un cuadradito en el portaobjetos que está en la placa con el equipo de microcultivo. Sembrando el hongo a identificar, con el asa de kolle en gancho en las cuatro esquinas y en el centro del bloque de agar. Luego se colocó el cubreobjetos sobre el bloque de APD. Se vertió agua destilada estéril por el borde de la placa de Petri, para proporcionar una adecuada humedad evitando que se deseque el medio de cultivo debido a lo prolongado de la incubación. Se Incubo a 25°C por 3 a 5 días. Transcurrido el periodo de tiempo se realizó la coloración con azul de lactofenol y el montaje para su respectiva identificación. 3.3.4. Determinación del efecto antagónico Para determinar el efecto antagónico in vitro de Trichoderma sp. sobre los patógenos Fusarium sp. y Colletotrichum sp. se empleó la técnica del enfrentamiento dual. a) Obtención de Trichoderma y fitopatógenos en tapete y block de gelosa78 El inoculo se preparó a partir de cepas de hongos antagónico (Trichoderma sp.) y hongos fitopatógenos (Colletotrichum sp. y Fusarium sp.) en medio APD, los cuales se incubaron a 25°C de 5 a 8 días. Luego de este tiempo se cosecharon las esporas (Fusarium de 5 días, Colletotrichum de 8 días y Trichoderma de 5 días) en 2,0 mL de solución salina fisiológica estéril, con hisopo estéril, hasta que se alcanzar una turbidez de 0,5 en escala de Mc Farland, para luego ser sembrados utilizando un hisopo estéril en placas con medio APD mediante estriaciones en 3 direcciones, se incubaron a 25°C por 5 a 8 días, para la obtención del crecimiento en forma de tapete (crecimiento uniforme), luego de este tiempo se obtuvo los trocitos de APD (blocks) con colonia fúngica usando un sacabocado de 6 mm de diámetro. b) Prueba de efecto antagónico: Técnica de cultivo dual74 Con ayuda de un sacabocados se cortaron áreas de 6 mm de diámetro de la colonia del hongo fitopatógeno y se sembró en un extremo de la placa Petri, dándoles una ventaja de crecimiento de 1 día para fusarium y 2 días para 20 colletotrichum, debido a su crecimiento lento, para el control se sembraron los hongos fitopatógenos (Colletotrichum sp. y Fusarium sp.) solos en la placa Petri, también con ventaja en crecimiento (1 día para Fusarium y 2 días para Colletotrichum), luego de ese tiempo se sembró al otro extremo de la placa Petri el 6 mm de diámetro de la colonia del antagonista Trichoderma sp. Se incubo a 25°C por diez días, se hizo mediciones del radio de crecimiento de los hongos enfrentados (crecimiento micelial) cada día comparando con el testigo (24 horas) por 8 días. Figura 1. La medición de crecimiento radial del micelio del fitopatógeno por el método de cultivo dual, propuesto por Fokkema 74 . Dónde: R1, radio de la colonia del fitopatógeno control; R2, radio de la colonia del fitopatógeno en enfrentamiento dual con Trichoderma. T, Trichoderma; F, fitopatógeno. 3.4. Tipo de investigación Básica – descriptivo 3.5. Diseño de investigación El presente está orientado a una investigación experimental, con un diseño completamente al azar (DCA) de un solo factor. Para Colletotrichum: Se evaluó el efecto inhibitorio de siete cepas nativas de Trichoderma spp. frente a cuatro cepas de Colletotrichum spp. que fueron aisladas de arveja y rocoto. Se realizó cuatro experimentos, cada una con siete tratamientos y tres repeticiones. Para Fusarium: Se evaluó el efecto inhibitorio de siete cepas nativas de Trichoderma spp. frente a cuatro cepas de Fusarium spp. que fueron aisladas de papa, palto y plátano. Se realizó cuatro experimentos, cada una con siete tratamientos y tres repeticiones. Factor: efecto antagónico de Trichoderma. Tratamientos: 7 tratamientos para cada una de las cepas de fitopatógenos Colletotrichum spp. y Fusarium spp.; un tratamiento está formado por 1 cepa de Trichoderma y una cepa fitopatógeno. 21 Tabla 1. Tratamientos para la prueba de efecto antagónico. Trata mientos Colletotrichum spp. Fusarium spp. AV-1 AV-2 RF-1 RF-2 F-1 F-2 F-3 F-4 T-1 T-1 x AV-1 T-1 x AV-2 T-1 x RF-1 T-1 x RF-2 T-1 x F-1 T-1 x F-2 T-1 x F-3 T-1 x F-4 T-2 T-2 x AV-1 T-2 x AV-2 T-2 x RF-1 T-2 x RF-2 T-2 x F-1 T-2 x F-2 T-2 x F-3 T-2 x F-4 T-3 T-3 x AV-1 T-3 x AV-2 T-3 x RF-1 T-3 x RF-2 T-3 x F-1 T-3 x F-2 T-3 x F-3 T-3 x F-4 T-4.1 T-4.1xAV-1 T-4.1 x AV-2 T-4.1 x RF-1 T-4.1 x RF-2 T-4.1 x F-1 T-4.1 x F-2 T-4.1 x F-3 T-4.1 x F-4 T-4,2 T-4,2 x AV-1 T-4,2 x AV-2 T-4,2 x RF-1 T-4,2 x RF-2 T-4,2 x F-1 T-4,2 x F-2 T-4,2 x F-3 T-4,2 x F-4 T-5 T-5 x AV-1 T-5 x AV-2 T-5 x RF-1 T-5 x RF-2 T-5 x F-1 T-5 x F-2 T-5 x F-3 T-5 x F-4 T-6 T-6 x AV-1 T-6 x AV-2 T-6 x RF-1 T-6 x RF-2 T-6 x F-1 T-6 x F-2 T-6 x F-3 T-6 x F-4 Variable de respuesta: Porcentaje de inhibición radial del crecimiento (PIRC) y niveles de micoparasitismo. 3.6. Análisis de datos 3.6.1. Determinación del porcentaje de inhibición radial del crecimiento (PIRC)79 El porcentaje de inhibición de Trichoderma sobre los hongos fitopatógeno de crecimiento se midió a través de la fórmula de Samaniego et al (1989) citada por de Ezziyyani78. ( ) Dónde: R1: radio del patógeno testigo (cm). R2: radio de inhibición del patógeno enfrentado al antagonista (cm). El PICR fue categorizado de 0 a 4 usando una escala de categoría de inhibición de crecimiento, citada por Ramírez5 donde: Tabla 2. Escala de categoría de inhibición de crecimiento PICR. CATEGORÍA INHIBICIÓN DE CRECIMIENTO 0 sin crecimiento o inhibición, 1 1% –25% inhibición del crecimiento 2 26% –50% inhibición del crecimiento 3 51% –75% inhibición del crecimiento 4 76% -100% de inhibición del crecimiento Con los datos obtenidos de PIRC se confeccionaron gráficas estadísticas del tipo descriptivo, para lo cual se empleó el programa Excel 2016, en caso del control no fue considerado para la representación gráfica. 22 3.7. Análisis estadístico Los experimentos se llevaron a cabo bajo un diseño completamente al azar (DCA). El análisis de datos se realizó mediante la prueba de Kruskal Wallis (α=0,05), cuyo valor se reporta con la sigla “H” y “p” es p valor, con el software estadístico MINITAB 16. 3.8. Determinación del Micoparasitismo Para indicar el micoparasitismo como posible mecanismo de acción se realizaron observaciones macroscópicas de los cultivos duales, tomándose como índice la invasión del antagonista sobre la superficie del micelio del fitopatógenos, se usó la escala creada por Elías y Arcos (1984) citada por Ramírez5, y donde se evaluó su potencial antagónico. Para la cual el cultivo dual se dejó por 8 días. Luego de esto se midió el grado de antagonismo, utilizando dicha escala que se ha empleado en estudios de micoparasitismo de Trichoderma contra fitopatógenos, (tabla 2). Tabla 3. Escala creada por Elías y Arcos (1984), Creada para la evaluación de la capacidad antagónica (micoparasitismo). GRADO CAPACIDAD ANTAGÓNICA POTENCIAL 0 Ninguna invasión de la superficie del fitopatógeno Muy malo 1 Invasión de ¼ de la superficie de la colonia del hongo fitopatógeno Malo 2 Invasión de ½ de la superficie de la colonia del hongo fitopatógeno Deficiente 3 Invasión total de la superficie de la colonia del hongo fitopatógeno Bueno 4 Invasión total de la superficie de la colonia del hongo fitopatógeno y esporulación sobre ella. Muy bueno 23 IV. RESULTADOS 24 25 Tabla 4. Relación de cepas de hongos antagonistas y fitopatógenos aislados. Código Cepa Microorganismo Origen T-1 Trichoderma sp. Suelo T-2 Trichoderma sp. Suelo T-3 Trichoderma sp. Suelo T-4.1 Trichoderma sp. Suelo T-4.2 Trichoderma sp. Suelo T-5 Trichoderma sp. Suelo T-6 Trichoderma sp. Suelo AV-1 Colletotrichum sp. Fruto de arveja (Pisum sativum) AV-2 Colletotrichum sp. Fruto de arveja (Pisum sativum) RF-1 Colletotrichum sp. Fruto de rocoto (Capsicum pubescens) RF-2 Colletotrichum sp. Fruto de rocoto (Capsicum pubescens) F-1 Fusarium sp. Tubérculo de papa (Solanum tuberosum) F-2 Fusarium sp. Tallo de palto (Persea americana) F-3 Fusarium sp. Tubérculo de papa (Solanum tuberosum) F-4 Fusarium sp. Fruto de plátano (Musa sp.) En la tabla 4 se observa la relación de cepas nativas de Trichoderma aisladas de suelo (T-1, T-2, T-3, T-4,1, T-4,2, T-5 y T-6) y los hongos fitopatógenos nativos aislados de vegetales. 26 Tabla 5. Porcentaje de inhibición del crecimiento radial de Colletotrichum sp cepa AV-1 en cultivo dual con Trichoderma spp. Tratamientos Mediana de % PIRC Trichoderma sp. (T-6) 45 Trichoderma sp. (T-5) 40 Trichoderma sp. (T-3) 40 Trichoderma sp. (T-4,1) 40 Trichoderma sp. (T-4,2) 40 Trichoderma sp. (T-1) 35 Trichoderma sp. (T-2) 35 H = 2.58, α = 0,05, p = 0.8459 En la tabla 5 se observa que las cepas de Trichoderma spp. Alcanzaron porcentajes de inhibición que va de 35 a 45% de reducción de crecimiento radial de Colletotrichum sp cepa AV-1, no existió diferencia significativa entre las medianas de los tratamientos; según Ramírez 5 todas las cepas se ubican en la categoría 2 (escala de categoría de inhibición PIRC). 27 Tabla 6. Porcentaje de inhibición del crecimiento radial de Colletotrichum sp. cepa AV-2 en cultivo dual con Trichoderma spp. Tratamientos Mediana de % PIRC Trichoderma sp. (T-1) 31,58 Trichoderma sp. (T-2) 31,58 Trichoderma sp. (T-3) 31,58 Trichoderma sp. (T-4,1) 31,58 Trichoderma sp. (T-5) 31,58 Trichoderma sp. (T-6) 31,58 Trichoderma sp. (T-4,2) 26,32 H = 1,83, α = 0,05, p = 0,918 En la tabla 6 se observa que las cepas nativas de Trichoderma spp. alcanzaron un porcentaje de inhibición que va de 26,32 a 31,58% de reducción de crecimiento radial de la cepa nativa de Colletotrichum sp AV-2, no existió diferencia significativa entre las medianas de los tratamientos; según Ramírez 5 todas las cepas se ubican en la categoría 2 (escala de categoría de inhibición PIRC). 28 Tabla 7. Porcentaje de inhibición del crecimiento radial de Colletotrichum sp. cepa RF-1 en cultivo dual con Trichoderma spp. Tratamientos Mediana de % PIRC Trichoderma sp. (T-6) 39,13 Trichoderma sp. (T-5) 39,13 Trichoderma sp. (T-4,2) 39,13 Trichoderma sp. (T-4,1) 39,13 Trichoderma sp. (T-3) 39,13 Trichoderma sp. (T-1) 34,78 Trichoderma sp. (T-2) 34,78 H = 3,45, α = 0,05, p = 0,6187 En la tabla 7 se observa que las cepas de Trichoderma spp. alcanzaron porcentajes de inhibición que va de 34,78 a 39,13 % de reducción de crecimiento radial de la cepa nativa de Colletotrichum sp RF-1, no existió diferencia significativa entre las medianas de los tratamientos; según Ramírez 5 todas las cepas se ubican en la categoría 2 (escala de categoría de inhibición PIRC). 29 Tabla 8. Porcentaje de inhibición del crecimiento radial de Colletotrichum sp. cepa RF-2 en cultivo dual con Trichoderma spp. Tratamientos Mediana de % PIRC Trichoderma sp. (T-6) 44,44 Trichoderma sp. (T-5) 44,44 Trichoderma sp. (T-3) 44,44 Trichoderma sp. (T-2) 44,44 Trichoderma sp. (T-1) 40,74 Trichoderma sp. (T-4,1) 40,74 Trichoderma sp. (T-4,2) 40,74 H = 4,92, α = 0,05, p = 0,3434 En la tabla 8 se observa que las cepas de Trichoderma spp. alcanzaron porcentajes de inhibición que van de 40,74 a 44,44 % de reducción de crecimiento radial de la cepa nativa de Colletotrichum sp RF-2, no existió diferencia significativa entre las medianas de los tratamientos; según Ramírez 5 todas las cepas se ubican en la categoría 2 (escala de categoría de inhibición PIRC). 30 Tabla 9. Porcentaje de inhibición del crecimiento radial de Fusarium sp. cepa F-1 en cultivo dual con Trichoderma spp. Tratamientos Mediana de % PIRC Trichoderma sp. (T-6) 48,39 Trichoderma sp. (T-5) 48,39 Trichoderma sp. (T-4,1) 48,39 Trichoderma sp. (T-3) 48,39 Trichoderma sp. (T-2) 48,39 Trichoderma sp. (T-4,2) 45,16 Trichoderma sp. (T-1) 35,48 H = 2,61, α = 0,05, p = 0,8288 En la tabla 9 se observa que las cepas nativas de Trichoderma spp. alcanzaron porcentajes de inhibición que va de 35,48 a 48,39% de reducción de crecimiento radial de la cepa nativa de Fusarium sp F-1, no existió diferencia significativa entre las medianas de los tratamientos; según Ramírez 5 todas las cepas se ubican en la categoría 2 (escala de categoría de inhibición PIRC). 31 Tabla 10.Porcentaje de inhibición del crecimiento radial de Fusarium sp. cepa F-2 en cultivo dual con Trichoderma spp. Tratamientos Mediana de % PIRC Trichoderma sp. (T-2) 38,1 Trichoderma sp. (T-4,1) 38,1 Trichoderma sp. (T-3) 33,33 Trichoderma sp. (T-4,2) 33,33 Trichoderma sp. (T-6) 33,33 Trichoderma sp. (T-1) 28,57 Trichoderma sp. (T-5) 28,57 H = 1,68, α = 0,05, p = 0,9416 En la tabla 10 se observa que las cepas nativas de Trichoderma spp. alcanzaron porcentajes de inhibición que va de 28,57 a 38,1 % de reducción de crecimiento radial de la cepa nativa de Fusarium sp. F-2, no existió diferencia significativa entre las medianas de los tratamientos; según Ramírez 5 todas las cepas se ubican en la categoría 2 (escala de categoría de inhibición PIRC). 32 Tabla 11. Porcentaje de inhibición del crecimiento radial de Fusarium sp. cepa F-3 en cultivo dual con Trichoderma spp. Tratamientos Mediana de % PIRC Trichoderma sp. (T-4,1) 61,11 Trichoderma sp. (T-5) 61,11 Trichoderma sp. (T-1) 58,33 Trichoderma sp. (T-2) 55,56 Trichoderma sp. (T-3) 55,56 Trichoderma sp. (T-6) 55,56 Trichoderma sp. (T-4,2) 52,78 H = 9,77, α = 0,05, p = 0,1112 En la tabla 11 se observa que las cepas nativas de Trichoderma spp. alcanzaron porcentajes de inhibición que va de 52,78 a 61,11% de reducción de crecimiento radial de la cepa nativa de Fusarium sp. F-3, no existió diferencia significativa entre las medianas de los tratamientos; según Ramírez 5 todas las cepas se ubican en la categoría 3 (escala de categoría de inhibición PIRC). 33 Tabla 12. Porcentaje de inhibición del crecimiento radial de Fusarium sp. cepa F-4 en cultivo dual con Trichoderma spp. Tratamientos Mediana de % PIRC Trichoderma sp. (T-6) 51,72 Trichoderma sp. (T-2) 48,28 Trichoderma sp. (T-3) 48,28 Trichoderma sp. (T-5) 48,28 Trichoderma sp. (T-4,1) 44,83 Trichoderma sp. (T-4,2) 44,83 Trichoderma sp. (T-1) 37,93 H = 6,23, α = 0,05, p = 0,3347 En la tabla 12 se observa que las cepas nativas de Trichoderma spp. alcanzaron porcentajes de inhibición que van de 37,93 a 51,72% de reducción de crecimiento radial de la cepa nativa de Fusarium sp. F-4, no existió diferencia significativa entre las medianas de los tratamientos; según Ramírez 5 , las cepas se ubican en la categoría 2 y 3 (escala de categoría de inhibición PIRC). 34 Tabla 13. Grado de invasión de cepas nativas de Trichoderma spp. en Colletotrichum spp. (Según Elías y Arcos, 1984). GRADO DE MICOPARASITISMO Trichoderma spp. Colletotrichum spp. AV-1 AV-2 RF-1 RF-2 T-1 0 0 4 2 T-2 4 4 4 4 T-3 4 4 4 4 T-4,1 2 1 2 1 T-4,2 4 4 4 4 T-5 4 1 4 4 T-6 0 4 3 3 En la tabla 13 se muestra que las cepas nativas de Trichoderma spp T-2, T-3 y T-4,2 lograron alcanzar el grado 4 de invasión micoparasitismo sobre las colonias de las cepas de nativas de Colletotrichum spp. AV-1, AV-2, RF-1 y RF-2; según Elías y Arcos corresponde a una invasión de colonia muy buena. T-5 alcanzó el grado 4 sobre las cepas de Colletotrichum AV-1, RF-1 y RF-2 (muy buena). T-6 alcanzo invasión de grado 4 sobre la cepa de Colletotrichum AV-2 y sobre RF-1 y RF-2 alcanzó el grado 3; según Elías y Arcos corresponde a una invasión de colonia muy buena y buena respectivamente. T-1 alcanzó el grado 4 de invasión frente a Colletotrichum RF-1 (muy buena). T-4,1 alcanzo grados que fueron de deficiente a malos. 35 Tabla 14. Grado de invasión de cepas nativas de Trichoderma spp. en Fusarium spp. (Según Elías y Arcos, 1984). GRADO DE MICOPARASITISMO Trichoderma spp. Fusarium spp. F-1 F-2 F-3 F-4 T-1 4 0 1 4 T-2 4 4 1 4 T-3 4 0 1 4 T-4,1 4 0 0 4 T-4,2 4 0 0 4 T-5 4 0 0 4 T-6 3 0 1 3 En la tabla 14 se muestra que las cepas nativas de Trichoderma spp. (T-1, T-2, T-3, T-4,1, T-4,2 y T-5) lograron alcanzar el grado 4 de invasión micoparasitismo y la cepa T-6 alcanzó el grado 3 frente a la cepas nativas de Fusarium F-1 y F-4; según Elías y Arcos corresponde a una invasión de colonia muy buena y buena respectivamente. Para Fusarium cepa F-2, la cepa de Trichoderma T-2 alcanzó el grado 4 de invasión (muy buena). Para la cepa de Fusarium F-3, las cepas nativas de Trichoderma spp. alcanzaron grados de invasión que fue de mala a muy mala. 36 37 V. DISCUSIÓN En la tabla 4 se observa la relación de cepas nativas de Trichoderma spp. aisladas de suelo (T-1, T-2, T-3, T-4,1, T-4,2, T-5 y T-6), y los hongos fitopatógenos nativos Colletotrichum spp. (AV-1, AV-2, RF-1 y RF2) y Fusarium spp. (F-1, F-2, F-3 y F-4) aislados de vegetales (arveja, papa y rocoto); estos resultados no difieren de los resultados reportados en Colombia por García L.8, quien aisló cepas nativas de Trichoderma spp. a partir de suelos de cultivos de sábila y arándano, del mismo modo aisló cepas nativas de fitopatógeno como Fusarium spp. y Colletotrichum spp. a partir de raíces, lesiones de tallo y suelo de plantas de sábila y arándano; con la diferencia que los fitopatógenos utilizados en esta investigación se aislaron de diferentes especies vegetales (arveja, papa y rocoto). Diferentes autores en sus investigaciones muestran aislamientos de Trichodermas y fitopatógenos tanto de suelos como vegetales. así, Arbito M.6 aisló Trichoderma spp. de suelos de cultivo de arroz, también aisló Fusarium spp. de granos de arroz con signos de Fusariosis. Díaz E.7 Aisló cepas de Trichoderma spp. y de Fusarium spp. presentes en los suelos de la Florícola “Happiness Flowers”. Martínez A.10 aisló Trichoderma sp. de suelo de cultivos de maracuyá (Passiflora edulis, variedad. flavicarpa), y el fitopatógeno Fusarium sp de plantas de maracuyá. Rudy N.11 aisló cepas nativas de Trichoderma spp. de suelo de cultivo de café, Fusarium sp. de plantas de café. (Coffea arabica). Llicahua D.13 Aisló cepas nativas de Trichoderma spp. de suelo de cultivo de cebolla, Fusarium sp. de plantas enfermas con sintomatología de infección fungal. En las tablas 5, 6, 7 y 8 se expresa los resultados de Trichoderma spp. mediante el cultivo dual frente a Colletotrichum spp., todas las cepas de Trichoderma spp. alcanzaron porcentajes de inhibición de 26,32 a 45%, estos datos se ubican en la categoría 2 (según Ramírez), todas las cepas de Trichoderma spp. no 38 alcanzan superar el 50% para considerar como buenos inhibidores de crecimiento para Colletotrichum spp. en todos los casos no existe diferencia significativa estadísticamente, esto quiere decir que todas las Trichoderma tienen un comportamiento igual y que no difieren en su inhibición frente a las cepas de Colletotrichum spp. Ramírez y col4, García L.8, Goñas M. y col.14, y Flores W15 encontraron porcentajes superiores que superan el 50% de inhibición; estas conclusiones no concuerdan con nuestros resultados, la diferencia se debe a que los fitopatógenos y los antagonistas tienen comportamientos diferentes dependiendo de la zona, habitad, temperatura de crecimiento y otros factores. En la tablas 13, se muestran el grado de invasión micoparasitismo de las cepas nativas de Trichoderma spp. T-2, T-3 y T-4,2 sobre las cepas nativas de Colletotrichum sp. AV-1, AV-2, RF-1 y RF-2; estos resultados se ubican dentro de la categoría grado 4, lo que indica una invasión total de la superficie de la colonia del hongo fitopatógeno y espórtula sobre ella, considerando esta con un potencial de muy bueno. Distintos resultados obtuvo Ramírez y col4, donde el PIRC fue de 100%, para Colletotrichum gloeosporioides con grado 4 de invasión. En cambio García L.8 obtuvo un PIRC de 59% para Colletotrichum spp. con una invasión de grado 1. Las cepas indicadas en las tablas 5, 6, 7 y 8 tienen un porcentaje de inhibición que no supera el 50%; sin embargo en la tabla 13, las cepas nativas de Trichoderma spp. T-2, T-3 y T-4,2, tienen un grado de invasión de 4, que se ubican dentro de la categoría muy buena; significa que a pesar de tener porcentajes bajos en PIRC y grado de micoparasitismo muy bueno; esto nos muestra que el mecanismo de acción de las cepas de Trichoderma indicadas, es el micoparasitismo. En las tablas 9, 10, 11 y 12 se expresa los resultados de las cepas de Trichoderma spp. mediante el cultivo dual frente a Fusarium spp., todas las cepas de Trichoderma spp.; alcanzaron un porcentaje de inhibición que va de 28,57 a 61,11%; datos que se ubican dentro de la escala de categoría de inhibición de crecimiento (PIRC), 2 y 3; no existió diferencia significativa entre las medianas de los tratamientos, quiere decir que todas las cepas de Trichoderma spp. tienen el mismo efecto inhibidor sobre Fusarium spp. En la tabla 11, todas las cepas de Trichoderma estudiadas logran tener una actividad inhibitoria sobre Fusarium sp. cepa F3, que va de 52,78% a 61,11%; según Ramírez5,se ubica en la categoría 3 dentro de la escala de inhibición de 39 crecimiento (PIRC); todas las cepas nativas de Trichoderma spp. sobrepasan el 50% por lo tanto se considera como buenos inhibidores. Nuestros resultados en este estudio coinciden con la investigación realizadas por Díaz E.7, obtuvo un potencial inhibitorio de T. harzianum sobre F. oxysporum de26,9%. Rudy, N. col.11; en cuya investigación las cepas de Trichoderma sp. Inhibió el crecimiento de Fusarium sp en un 37%. Así mismo Michel A. y col.12; cuyo resultados de la investigación con cepas nativas de Trichoderma spp. inhibieron en 62,9% frente a F. oxysporum. Así también García L.8, logro demostrar en su trabajo de investigación, que todas las cepas de Trichoderma spp. inhibieron el crecimiento de F. oxysporum en un 62,9% y frente a Fusarium spp. con un 72% de PIRC.; Así mismo Arbito, M.6 en su investigación logro demostrar resultados similares al nuestro, al enfrentar 4 cepas de Trichoderma spp. frente a Fusarium spp. con un inhibición de crecimiento de 50 y 67%. Superiores resultados lo obtuvieron Ramírez, J. y col.5, en sus resultados 2 cepas de T. asperellum inhibieron el crecimiento de Fusarium oxysporum en 70 y 84%. Así mismo Martínez, A.10 en su trabajo de investigación, demostró que Trichoderma sp. tuvo un crecimiento de inhibición frente a Fusarium solani con porcentajes que alcanzaron de 69,7% a 72,35%. En la misma tabla 11 todas las cepas de Trichoderma spp. que lograron una inhibición de crecimiento que va de 52,78% a 61,11%; a pesar de ello estas cepas nativas presentan un grado de micoparasitismo e invasión de colonia que va de mala a muy mala (tabla 14); significa que las cepas nativas de Trichoderma spp. son buenas inhibiendo el crecimiento de la cepa de Fusarium sp. F-3, pero no presentan invasión de colonia por lo que el micoparasitismo no es el mecanismo de acción de estas cepas nativas de Trichoderma spp. En las tablas 14, se muestran el grado de invasión micoparasitismo de las cepas nativas de Trichoderma spp. (T-1, T-2, T-3, T-4,1, T-4,2 y T-5) sobre las cepas nativas de Fusarium sp F1 y F-4, lograron ubicarse dentro del grado de micoparasitismo 4 y una invasión de colonia muy buena, según Elías y Arcos lo que significa una invasión total de la superficie sobre la colonia del hongo fitopatógeno y espórtula sobre ella; el mecanismo de acción de estas cepas nativas de Trichoderma spp. (T-1, T-2, T-3, T-4,1, T-4,2 y T-5) sobre las cepas nativas de Fusarium sp F1 y F-4, es el micoparasitismo; sin embargo estas cepas no superan el 50% de PIRC, con un comportamiento de inhibición deficiente. 40 Nuestros resultados coinciden con los resultados obtenidos en Colombia por García L.8, donde las cepas de Trichoderma spp. logran inhibir el crecimiento de Fusarium spp. en 72%, Pero al medir el grado de invasión micoparasitismo solo alcanzo grado 1 de invasión; lo mismo Llicahua, D.13 en su investigación, las 2 cepas de Trichoderma spp. (TES-1 y TET-1) inhibieron el crecimiento de Fusarium sp. en un 86,5 y 76,3% respectivamente; al medir su micoparasitismo, también alcanzó solo el gado 1 de invasión de colonia. Diferentes resultados obtuvieron en Colombia por Ramírez, J. y col.5, en sus resultados 2 cepas de T. asperellum inhibieron el crecimiento de Fusarium oxysporum en 70 y 84%, y su nivel de invasión fue de grado 3 y 4 respectivamente. Al igual que Vargas, R.16, en su investigación T. koningiopsis y T.harzianum inhibieron el crecimiento de F. oxysporum en 77,45% y 83,40% respectivamente, y obteniendo un micoparasitismo de grado 4. Díaz E.7 en Ecuador, en el que el potencial de T. harzianum sobre F. oxysporum fue 26,9%, y su micoparasitismo fue de grado 0, es decir que no hubo invasión. 41 VI. CONCLUSIONES 1. Todas las cepas de Trichoderma spp. alcanzaron un porcentaje de inhibición que va de 26,32 a 45% sobre Colletotrichum spp, las cuales se ubican en la categoría 2, no logran superar el 50% para ser considerados como buenos inhibidores de crecimiento para Colletotrichum spp.; estadísticamente todas las cepas Trichoderma spp. no difirieron en su inhibición frente a las cepas de Colletotrichum spp. 2. Todas las cepas de Trichoderma spp. alcanzaron un porcentaje de inhibición de crecimiento sobre Fusarium que va de 28,57 a 61,11%, las cuales se ubicaron en la categorías 2 y 3; en tabla 10 todas las cepa de Trichoderma spp. lograron superar el 50% de PIRC. 3. Las cepas nativas de Trichoderma T-2, T-3 y T-4.2 lograron alcanzar un grado de invasión de 4 sobre colonias de Colletotrichum spp., ubicándose dentro de la categoría de muy buena. 4. La cepas nativas de Trichoderma T-1, T-2, T-3, T-4,1 T-4,2 y T5 frente a las cepas nativas de Colletotrichum sp. F-1 y F-4, alcanzaron un grado de invasión de 4 que se ubican dentro de la categoría muy buena; sin embargo en la tabla 11, todas las cepas de Trichoderma spp., que alcanzaron un PIRC mayor al 50%, mostraron una invasión de colonia o micoparasitismo de malo a muy malo. 42 43 VII. RECOMENDACIONES 1. Realizar estudios similares a nuestra investigación con otros fitopatógenos de cultivos locales, utilizando las cepas nativas de Trichoderma spp. aisladas en este presente trabajo, para conocer su efectividad sobre estos fitopatógenos, a través de diseños experimentales como: antagonismo a diferentes temperaturas, concentraciones de esporas, etc. 2. Realizar ensayos de control de Colletotrichum spp. y Fusarium spp. aislados en la presente investigación en condiciones de invernadero aplicando la cepa de Trichoderma spp. para determinar la concentración de esporas apropiadas para su control. 44 45 VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. García, R.; Riera, R., Zambrano, C. y Gutiérrez, L. Desarrollo de un fungicida biológico a base de una cepa de Trichoderma harzianum proveniente de la Región Andina Venezolana. Fitosanidad [revista en internet] 2006 [acceso 25 de julio de 2019]; 10(2): 115. Disponible en: https://www.redalyc.org/pdf/2091/209116102005.pdf 2. Bravo A.; Ibarra J.; Del Rincón M.; Galindo E.; Patiño M.; Serrano L. et al. Los microorganismos en el control de insectos y patógenos. Cuernavaca, México. Revista, Latinoamericana de Microbiología [Revista en internet] 2006 [acceso 28 de Julio de 2018]; 48(2). 113 -120 pp. Disponible en: https://www.medigraphic.com/pdfs/lamicro/mi-2006/mi062k.pdf 3. Correa, G; Lavalett, L; Galindo, M. P & Afanador, L. Uso de métodos multi variantes para la agrupación de aislamientos de Colletotrichum spp. Con base En características morfológicas y culturales. Rev. Fac. Nac. Agron. [Revista en internet] 2007 [acceso 22 de julio de 2018]; 60(1):3671-3690. Disponible en: http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0304- 28472007000100004 4. SEMINIS. Qué es y cómo ataca el Fusarium; 2017 [Internet] [acceso 20 de julio de 2019]. Disponible en: https://www.seminis.mx/blog-que-es-y-como- ataca-el-fusarium/ 5. Ramírez, J., Trujillo, J. Osorio, V. Jaramillo, M. Botero, L. “In vitro antagonism of Trichoderma asperellum against Colletotrichum gloeosporioides, Curvularia lunata, and Fusarium oxysporum,” Rev. UIS Ing., [Revista en internet] 2019 [Acceso 05 de marzo de 2019]; vol. 18, no. 2, pp. 159-166. Disponible en: https://revistas.uis.edu.co/index.php/revistauisingenierias/article/view/8954/9 182 6. Arbito, M. Evaluación in vito de la Capacidad Antagonista De Trichoderma spp. frente a Fusarium spp. [Tesis título] Repositorio Institucional de la Universidad Politécnica Salesiana. Cuenca -Ecuador. 2017 [acceso 20 de julio de 2018]. Disponible en: https://dspace.ups.edu.ec/bitstream/123456789/14419/1/UPS-CT007088.pdf 7. Díaz E. Evaluación in vitro de la actividad de Trichoderma spp. sobre Fusarium spp. como alternativa al uso de fungicidas químicos que producen contaminación ambiental en la florícola Happines Flowers. [Tesis título] Repositorio Institucional de la Escuela Superior Politécnica De Chimborazo. Ecuador 2016. [Acceso 24 de julio de 2018]. Disponible en: http://dspace.espoch.edu.ec/bitstream/123456789/6193/1/236T0225.pdf 8. García, L. Evaluación Del Antagonismo de Cepas de Trichoderma spp. Frente a Cepas de Fusarium spp. Y Colletotrichum spp. Aisladas de Cultivos Orgánicos de Sábila (Aloe vera) Y Arándano (Vaccinium corymbosum). Rev. Teckne [revista en internet] 2015 [acceso 20 de julio de 2018]; 13(1): 56-66, disponible en: http://www.unihorizonte.edu.co/revistas/index.php/TECKNE/article/view/149/ 144 9. Vargas, H. y Gilchrist, E. Producción de enzimas hidrolíticas y actividad antagónica de Trichoderma asperellum sobre dos cepas de Fusarium aisladas de cultivos de tomate (Solanum lycopersicum). Rev. Mex. de Micología [revista en internet] 2015 [Acceso 24 de julio de 2018]. vol. 42: 9- 16. Disponible en: http://www.scielo.org.mx/pdf/rmm/v42/v42a3.pdf https://www.redalyc.org/pdf/2091/209116102005.pdf https://www.medigraphic.com/pdfs/lamicro/mi-2006/mi062k.pdf http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0304-28472007000100004 http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0304-28472007000100004 https://www.seminis.mx/blog-que-es-y-como-ataca-el-fusarium/ https://www.seminis.mx/blog-que-es-y-como-ataca-el-fusarium/ https://revistas.uis.edu.co/index.php/revistauisingenierias/article/view/8954/9182 https://revistas.uis.edu.co/index.php/revistauisingenierias/article/view/8954/9182 https://dspace.ups.edu.ec/bitstream/123456789/14419/1/UPS-CT007088.pdf http://dspace.espoch.edu.ec/bitstream/123456789/6193/1/236T0225.pdf http://www.unihorizonte.edu.co/revistas/index.php/TECKNE/article/view/149/144 http://www.unihorizonte.edu.co/revistas/index.php/TECKNE/article/view/149/144 http://www.scielo.org.mx/pdf/rmm/v42/v42a3.pdf 46 10. Martínez, A. Evaluación y selección de cepas de Trichoderma sp. para control biológico de Fusarium sp. en maracuyá (Passiflora edulis, variedad. flavicarpa), en condiciones in vitro. [Tesis título] Repositorio Institucional de la Universidad Técnica de Ambato. 2012 [Acceso 05 de marzo de 2019]; http://repositorio.uta.edu.ec/bitstream/123456789/3069/3/BQ.35.pdf 11. Rudy N.; Hugh S.; Almanza J. y Loza, M. Evaluación de la capacidad biocontroladora de cepas nativas de Trichoderma spp. sobre Rhizoctonia sp y Fusarium sp en café (Coffea arabica) en condiciones experimentales. Journal of the Selva Andina Research Society [revista en internet] 2011 [acceso 20 de Julio de 2018]; 2(1): 43-52, disponible en: http://www.scielo.org.bo/pdf/jsars/v2n1/a06.pdf 12. Michel A., Otero M., Solano, L., Ariza, R., Barrios, A. y Rebolledo, A. Biocontrol in vitro con Trichoderma spp. de Fusarium subglutinans (Wollenweb. y Reinking) Nelson, Toussoun y Marasas y F. oxysporum Schlecht., agentes causales de la “escoba de bruja” del mango (Mangifera indica L.). Revista Mexicana de Fitopatología [Revista en internet] 2009 [acceso 20 de Julio de 2018]; 27:18-26. Disponible en: http://www.scielo.org.mx/pdf/rmfi/v27n1/v27n1a3.pdf 13. Llicahua, D. Aislamiento y efecto antagonista “in vitro” de Trichoderma spp. frente a Fusarium sp. del cultivo de cebolla de los distritos de Santa Rita de Siguas y de Tiabaya– Arequipa-2018. [Tesis título] Repositorio Institucional de la Universidad Nacional De San Agustín De Arequipa. [Acceso 05 de marzo de 2019]. Disponible en: http://repositorio.unsa.edu.pe/bitstream/handle/UNSA/6775/BIllcudv.pdf?seq uence=1&isAllowed=y 14. Goñas, M., Bobadilla Rivera, L. G., Rascón Barrios J. y Vera Obando N. Y. Efecto in vitro de controladores biológicos sobre Colletotrichum spp. y Botrytis spp. Rev. de investig. agroproducción sustentable [Revista en internet] 2017 [acceso el 20 de julio de 2018]; 1(2): 25-31. Disponible en: http://revistas.untrm.edu.pe/index.php/INDESDOS/article/view/359/403 15. Flores, W. “Control biológico in vitro de Colletotrichum gloesporioides causante de la antracnosis frente a Clonostachys rosea, Fusarium oxysporum y Trichoderma harzianum.” [Tesis título] Repositorio Institucional de la Universidad Nacional de Trujillo. [Acceso 05 de marzo de 2019]. 2016. Disponible en: http://www.dspace.unitru.edu.pe/bitstream/handle/UNITRU/10786/Flores%20 Bazauri%2c%20Walter%20Daniel.pdf?sequence=1&isAllowed=y 16. Vargas, R. Antagonismo de Trichoderma Koningiopsis y Trichoderma Harzianum sobre Fusarium Oxysporum F. SP. Cepae y Phoma Terrestris in Vitro. [Tesis título] Repositorio Institucional de la Universidad Nacional de San Agustín de Arequipa. [Acceso 05 de marzo de 2019]. 2014. Disponible en: http://repositorio.unsa.edu.pe/bitstream/handle/UNSA/3193/AGvaverh.pdf?s equence=1&isAllowed=y 17. Torres, S. Efecto "in vitro" de especies nativas de Trichoderma sobre la germinación y el crecimiento de Colletotrichum sp. aislado del distrito de Jaen -Cajamarca. [Tesis para título] Repositorio de la Universidad Nacional de Trujillo. [acceso el 20 de julio de 2018] 2012. 18. Pérez, N. Manejo Ecológico de Plagas. La Habana, Cuba. Editorial Centro de Estudios de Desarrollo Agrario y Rural. 2004. 127 – 284 pp. 19. Orietta, F. y Larrea, V. Microorganismos antagonistas para el control fitosanitario. Manejo Integrado de Plagas (Costa Rica). Instituto de http://repositorio.uta.edu.ec/bitstream/123456789/3069/3/BQ.35.pdf http://www.scielo.org.bo/pdf/jsars/v2n1/a06.pdf http://www.scielo.org.mx/pdf/rmfi/v27n1/v27n1a3.pdf http://repositorio.unsa.edu.pe/bitstream/handle/UNSA/6775/BIllcudv.pdf?sequence=1&isAllowed=y http://repositorio.unsa.edu.pe/bitstream/handle/UNSA/6775/BIllcudv.pdf?sequence=1&isAllowed=y http://revistas.untrm.edu.pe/index.php/INDESDOS/article/view/359/403 http://www.dspace.unitru.edu.pe/bitstream/handle/UNITRU/10786/Flores%20Bazauri%2c%20Walter%20Daniel.pdf?sequence=1&isAllowed=y http://www.dspace.unitru.edu.pe/bitstream/handle/UNITRU/10786/Flores%20Bazauri%2c%20Walter%20Daniel.pdf?sequence=1&isAllowed=y http://repositorio.unsa.edu.pe/bitstream/handle/UNSA/3193/AGvaverh.pdf?sequence=1&isAllowed=y http://repositorio.unsa.edu.pe/bitstream/handle/UNSA/3193/AGvaverh.pdf?sequence=1&isAllowed=y 47 Investigaciones de Sanidad Vegetal La Habana. Cuba [Revista en internet] 2001 [acceso el 20 de julio de 2018] No. 62 p. 96 - 100, disponible en: http://www.sidalc.net/repdoc/A2120e/A2120e.pdf 20. Infante, D., Martínez, B., González, N. y Reyes Y. Mecanismos de acción de Trichoderma frente a hongos fitopatógenos. Rev. Protección Veg. [Revista en internet] 2009 [acceso el 20 de julio de 2018] Vol. 24 No. 1: 14-21, disponible en: http://scielo.sld.cu/pdf/rpv/v24n1/rpv02109.pdf 21. Rifai, M. Revision of the genus Trichoderma. Mycol. Pap. 1969; 116: 1-56. 22. Villegas M. Trichoderma. Características generales y su potencial biológico en la agricultura sostenible. [Revista en internet] 2005 . Disponible en: http://www.oriusbiotecnologia.com/tecnica/128-trichoderma-pers- caracteristicas-y-su-potencial -biologico-en-la-agricultura-sostenible 23. Jaklitsch, W. y Voglmayr, H. New combinations in Trichoderma (Hypocreaceae, Hypocreales). Mycotaxon [Revista en internet] 2013 [acceso el 20 de julio de 2018] 126: 143-156, disponible en: http://docserver.ingentaconnect.com/deliver/connect/mtax/00934666/v126n1/ s20.pdf?expires=1533242236&id=0000&titleid=41000038&checksum=C663 BBC045A3C1A8C75CE9DFDDA7BDD2 24. Argumedo, R.; Alarcón, A.; Ferrera, R. y Peña, J. Los géneros fúngico Trichoderma y su relación con contaminantes orgánicos e inorgánicos. Rev. Int. Contam. Ambient. [revista en internet] 2009 Nov [acceso 21 de Julio de 2018]; 25(4): 257-269, disponible en: http://www.scielo.org.mx/pdf/rica/v25n4/v25n4a6.pdf 25. Caiza, V. Colección, identificación y pruebas de eficacia in vitro de (Trichoderma sp). en el control biologico de (Botrytis cinérea) en la finca Florícola Picasso Roses [Tesis título]. Repositorio Institucional de la Universidad Politécnica Salesiana; [acceso el 20 de julio de 2018] 2013. Disponible en: https://dspace.ups.edu.ec/bitstream/123456789/5073/1/UPS- CYT00104.pdf 26. Poalacin, J. Estudio Del Adecuado Crecimiento Del Hongo Trichoderma harzianum Y Trichoderma hamatum en Sustrato Solido [Tesis para título]. Repositorio Institucional de la Universidad Central Del Ecuador [acceso el 20 de julio de 2018]; 2015. Disponible en: http://www.dspace.uce.edu.ec/bitstream/25000/4776/1/T-UCE-0017-128.pdf 27. Martínez, B.; Infante, D., y Reyes, Y. Trichoderma spp. Y su función en el control de plagas en los cultivos. Rev. Protección veg. [Revista en internet] 2013 [acceso 20 de julio de 2018]; 28(1): 1-11, Disponible en: http://scielo.sld.cu/pdf/rpv/v28n1/rpv01113.pdf 28. Flores, V. Determinación del efecto antagónico de cepas nativas de Trichoderma spp frente a Mycosphaerella fifiensis en plantas de banano a nivel de invernadero [Tesis para título]. Repositorio Institucional de la Escuela Superior Politécnica De Chimborazo Riobamba; [acceso el 20 de julio de 2018] 2015, disponible en: http://dspace.espoch.edu.ec/bitstream/123456789/4065/1/236T0127%20UD CTFC.pdf 29. Sivan A, Chet I. Degradation of fungal cell walls by lytic enzymes of Trichoderma harzianum. J Gen Microbiol. 1989;135:675-682. 30. Howell C. Mechanisms employed by Trichoderma species in the biological control of plant diseases: The history and evolution of current concepts. Plant Diseases. 2003;87(1):4-10. 31. Vinale F, Sivasithamparamb K, Ghisalbertic EL, Marraa R,Woo L, Lorito M. Trichoderma plant pathogen interactions. Soil Biology & Biochemistry. 2008;40:1-10. http://www.sidalc.net/repdoc/A2120e/A2120e.pdf http://scielo.sld.cu/pdf/rpv/v24n1/rpv02109.pdf http://docserver.ingentaconnect.com/deliver/connect/mtax/00934666/v126n1/s20.pdf?expires=1533242236&id=0000&titleid=41000038&checksum=C663BBC045A3C1A8C75CE9DFDDA7BDD2 http://docserver.ingentaconnect.com/deliver/connect/mtax/00934666/v126n1/s20.pdf?expires=1533242236&id=0000&titleid=41000038&checksum=C663BBC045A3C1A8C75CE9DFDDA7BDD2 http://docserver.ingentaconnect.com/deliver/connect/mtax/00934666/v126n1/s20.pdf?expires=1533242236&id=0000&titleid=41000038&checksum=C663BBC045A3C1A8C75CE9DFDDA7BDD2 http://www.scielo.org.mx/pdf/rica/v25n4/v25n4a6.pdf https://dspace.ups.edu.ec/bitstream/123456789/5073/1/UPS-CYT00104.pdf https://dspace.ups.edu.ec/bitstream/123456789/5073/1/UPS-CYT00104.pdf http://www.dspace.uce.edu.ec/bitstream/25000/4776/1/T-UCE-0017-128.pdf 48 32. Hoyos-Carvajal L, Chaparro P, Abramsky M, Chet I, Orduz S. Evaluación de aislamientos de Trichoderma spp. contra Rhizoctonia solani y Sclerotium rolfsii bajo condiciones in vitro y de invernadero. Agron Colomb. 2008; 26 (3): 451-458. 33. Chet I, Benhamou H. Mycoparasitism and letic enzymes. In: Harman G, Kubicek C. (Eds.) Trichoderma & Gliocladium. Enzymes, biological control and commercial applications. Taylor & Francis. London, UK, 1998. p.153- 152. 34. Küçük Ç, Kivanç M. In vitro Antifungal Activity of Strains of Trichoderma harzianum. Turk J Biol. 2004;28:111-115. 35. Nico I, Monaco I, Del Bello G, Alippi H. Efecto de la adición de enmiendas orgánicas al suelo sobre la capacidad patogénica de Rhizoctonia solani: II Micoflora asociada y antagonismo in vitro de los aislados más frecuentes. RIA. 2005;34(Pt II)(1):29-44. 36. Chet I.; Harman G.; Baker R. Trichoderma hamatum: Its hyphal interactions with Rhizoctonia solani and Pythiumspp. Microbial Ecology. 1981;7:29-38. 37. Hjeljord L. & Tronsmo A. Trichoderma and Gliocladium in biological control: an overview. In: Harman G, Kubicek C. (Eds.) Trichoderma & Gliocladium. Enzymes, biological control and commercial applications. Taylor & Francis. London, UK, 1998. p. 131-151. 38. Dennis C. & Webster J. Antagonistic properties of species groups of Trichoderma. I. Production of non-volatile antibiotics. Transactions of the British Mycological Society. 1971;57:25-39. 39. Sivasithamparam K, & Ghisalberti L. Secondary metabolism in Trichoderma and Gliocladium. En: Harman GE, Kubicek CP. (Eds.), Trichoderma and Gliocladium. Taylor and Francis Ltd., London, 1998. pp. 139-191. 40. Castro R. Bioproducto a base de Trichoderma harzianum Rifai para el manejo de la sigatoka negra (Mycosphaerella fifiensis Morelet) en bananeras organicas (tesis doctoral). Santa Clara, Cuba: Universidad Central “Marta Abreu” De Las Villas. 2015. 41. Hyde K.; Cai L.; Cannon P.; Crouch J.; Crous P.; Damm U.; et al. 2009a. Colletotrichum – names in current use. Fungal Diversity 39:147-182. Disponible en línea: http:// www.fungaldiversity.org/fdp/sfdp/FD39-7.pdf 42. Udayanga D.; Manamgoda D.; Liu X.; Chukeatirote E y Hyde KD. What are the common anthracnose pathogens of tropical fruits? Fungal Diversity 61:165-179. 2013. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1007/s13225-013- 0257-2 43. Réblová M.; Gams W y Seifert K. Monilochaetes and allied genera of the Glomerellales, and a reconsidera¬tion of families in the Microascales. Studies in Mycology [revista en internet] 2011 [acceso 23 de julio de 2018]. 68:163-191. Disponible en: http://dx.doi.org/10.3114/sim.2011.68.07 44. Cepero de García, M.; Restrepo, R.; Franco-Molano, A.; Cardenas, T.; y Vargas, E. Biología de hongos. Bogota, Colombia: Ediciones Unia Andes. 2012. 45. Cannon, P.; Damm, U.; Johnston, P.; y Weir, B. Colletotrichum – current status and future directions. Studies in Mycology. [Revista en internet] 2012 [acceso 23 de julio de 2018]. 73: 181–213. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3458418/pdf/simycol_73_1_0 04.pdf 46. Agrios, G. Plant pathology. 5 ed. California, US, Elsevier Academic Press. 2005. 922 p. 47. Contreras, C. Caracterización y pruebas de patogenicidad cruzada entre aislamientos de Colletotrichum spp. Obtenidos de frutos de lulo (Solanum http://dx.doi.org/10.3114/sim.2011.68.07 49 quitoense Lam), tomate de árbol (Solanum betacea Sendt), granadilla (Passiflora ligularis Juss), mango (Mangifera indica L) y tallos de mora (Rubus glaucus Benth) con síntomas de antracnosis. [Tesis de título] Bogotá: Repositorio Institucional de la Pontificia Universidad Javeriana [acceso el 20 de julio de 2018]; 2006. Disponible en: https://repository.javeriana.edu.co/bitstream/handle/10554/8253/tesis239.pdf ?sequence=1&isAllowed=y 48. Xiao, C.; MacKenzie, S. y Legard, D. E.. Genetic and pathogenic analyses of Colletotrichum gloeosporioides isolates from strawberry and noncultivated host. Phytopathology [revista en internet] 2004 [acceso 23 de julio de 2018] 94:446-453. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18943762 49. Landero N., Lara F., Andrade P., Aguilar L. y Aguado G. Alternativas para el control de Colletotrichum spp. Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas [revista en internet] 2016 [acceso 23 de julio de 2018] Vol.7 Núm.5 1189- 1198, p. 30 Disponible en: http://www.scielo.org.mx/pdf/remexca/v7n5/2007- 0934-remexca-7-05-1189.pdf 50. Cerón, L. y Buitrago G. Crecimiento y desarrollo de Colletotrichum gloeosporioides f. alatae durante su cultivo en medios líquidos. Acta Biológica Colombiana [revista en internet] 2006 [acceso 23 de julio de 2018] 11(1), 99-109. Disponible en: http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0120- 548X2006000100008 51. Correa, G; Lavalett, L; Galindo, M. P & Afanador, L. Uso de métodos multi variantes para la agrupación de aislamientos de Colletotrichum spp. Con base En características morfológicas y culturales. Rev. Fac. Nac. Agron. Medellín. [Revista en internet] 2007 [acceso 22 de julio de 2018]; 60(1):3671-3690. Disponible en: http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0304- 28472007000100004 52. Contreras, C. Caracterización y pruebas de patogenicidad cruzada entre aislamientos de Colletotrichum spp. Obtenidos de frutos de lulo (Solanum quitoense Lam), tomate de árbol (Solanum betacea Sendt), granadilla (Passiflora ligularis Juss), mango (Mangifera indica L) y tallos de mora (Rubus glaucus Benth) con síntomas de antracnosis. [Trabajo de grado] Repositorio Institucional de la Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá; 2006. Disponible en: http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis239.pdf 53. Oliveira, R.; Moral, J.; Bouhmidi, K. y Trapero, A. Caracterización morfológica y cultural de aislados de Colletotrichum spp. Causante de la antracnosis en olivo. Bol. San. Veg. Plagas [revista en internet] 2005 [acceso 22 de julio de 2018]; 31, 531-548. Disponible en: https://helvia.uco.es/bitstream/handle/10396/2420/Trapero_Casas_9.pdf?se quence=1&isAllowed=y 54. Velastegui, F.; Crespo, R. y Cabezas, F. Plagas y enfermedades en plantaciones de Teca (Tectona grandis L.F) en la zona de Balzar, Provincia de Guayas. Ciencia y tecnología [revista en internet] 2009 [acceso 22 de julio de 2018]; 3(1). 15 – 22. Disponible en: http://www.uteq.edu.ec/revistacyt/publico/archivos/C1_3n12010.pdf 55. Jeffries, P.; Dodd, C.; Jeger, J. y Plumbey, A. The biology and control of Colletotrichum species on tropical crops. Plant Pathology [revista en internet] 1990 [acceso 22 de julio de 2018]; (39) 343-366. Disponible en: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1365-3059.1990.tb02512.x https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18943762 http://www.scielo.org.mx/pdf/remexca/v7n5/2007-0934-remexca-7-05-1189.pdf http://www.scielo.org.mx/pdf/remexca/v7n5/2007-0934-remexca-7-05-1189.pdf 50 56. Cerón, R.; Higuera, M.; Sánchez, N.; Bustamante, S. y Buitrago, G. Crecimiento y desarrollo de Colletotrichum gloeosporioides f alatae Durante su cultivo en medios líquidos. Acta biológica colombiana [revista en internet] 2006 [acceso 22 de julio de 2018]; 11 (1), 99-109. Disponible en: https://revistas.unal.edu.co/index.php/actabiol/article/view/27148/27421 57. DECCO Naturally Postharvest: ¿Qué es la antracnosis y cómo afecta a los cultivos? [Acceso 22 de julio de 2019]. Disponibles en: https://www.deccoiberica.es/que-es-la-antracnosis-y-como-afecta-a-los- cultivos/ 58. Impactos Actuales y potenciales de las Enfermedades de los Cultivos Perennes de la Amazonia Y Posibilidades de Control Para el Desarrollo Sostenible de la Región, Tratado De Cooperación Amazónica. Caracas, Venezuela-Setiembre 1999. [acceso 22 de Julio de 2018] Disponibles en: http://docplayer.es/8499195-Tratado-de-cooperacion-amazonica-secretaria- pro-tempore-caracas-venezuela-dgis-secretaria-pro-tempore-venezuela.html 59. HERBARIO VIRTUAL. Catedra de fitopatología. Facultad de Agronomia de la Universidad de Buenos Aires. [Acceso 22 de julio de 2019]. Disponible: http://herbariofitopatologia.agro.uba.ar/?page_id=422 60. Villa, A.; Perez, R.; Moreles, H.; Basurto, M.; Soto, J. & Martinez, E. Situacion actual en el control del Fusarium spp. Y evaluación de la actividad antifungica de extractos vegetales. Acta Agron. [Revista en internet] 2015 [acceso 22 de julio de 2018]; 64(2):194 – 205, Disponible en: https://revistas.unal.edu.co/index.php/acta_agronomica/article/view/43358/50 649 61. Ochoa, B. Sistematización del cerapio de hongos filamentosos de la Universidad Politécnica Salesiana Sede Cuenca. [Trabajo para título] Universidad Politécnica Salesiana Sede Cuenca; 2017. Disponible en: https://dspace.ups.edu.ec/bitstream/123456789/14431/1/UPS-CT007094.pdf 62. Groenewald, S. Biology, pathogenicity and diversity of Fusarium oxysporum f.sp. cubense. [Trabajo para maestría] Sudáfrica, Universidad of Pretonia. Pretonia; 2005, Disponible en: https://repository.up.ac.za/bitstream/handle/2263/30587/00dissertation.pdf?s equence=1&isAllowed=y 63. Díaz de Castro, F.; Restrepo, M. y Rojas, W. Microbiologia de las infecciones humanas. Primera edición. Corporación para la Investigacion Biologica. Medellin. Colombia. 2007. 64. Huaynalaya, M. Eficiencia del control biológico de Fusarium spp. que causa pudrición radicular en arveja (Pisum sativun L.) mediante bacterias antagónicas. [Tesis para título] Universidad Nacional Del Centro Del Perú; 2016. Disponible en: http://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:xc3daw- rkfAJ:repositorio.uncp.edu.pe/bitstream/handle/UNCP/1043/TESIS.pdf%3Fs equence%3D1%26isAllowed%3Dy+&cd=1&hl=es&ct=clnk&gl=pe 65. Gutiérrez, R. Hongos Contaminantes Comunes. [internet]. [acceso 19 de julio de 2018] Disponible en: http://www.telmeds.org/wp- content/uploads/2011/08/Apuntes-III-Parcial-Micologia-y- Virolog%C3%ADa.pdf 66. Nelson, P.; Tammen, R. y Baker, R. Life cycle and epidemiology of Fusarium oxysporum. 51-80. 1981. In M. E. Mace, A: A: Bell and C. C. H. Beckman. (Eds.). Fungal wilt diseases of plants. Academic Press. New York. 67. Garret, S. Pathogenic root- infecting fungi. Cambridge press. 294p. 1977. 68. Ortoneda M.; Guarro J.; Madrid M.; Caracuel Z.; Roncero M.; Mayayo E. y Di Pietro A. Fusarium oxysporum as a Multihost Model for the Genetic https://www.deccoiberica.es/que-es-la-antracnosis-y-como-af