PRESENTADO POR: Dr. Marco Rolando ARONÉS JARA UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTÓBAL DE HUAMANGA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA TESIS: Optimización de la obtención del extracto hidroalcohólico de las semillas de Silybum marianum de la región de Ayacucho Bach. Cris Yovana ORE ROJAS ASESOR: Para optar el título profesional de: QUÍMICO FARMACÉUTICO AYACUCHO - PERÚ 2025 iii A mis padres y mis hermanos por su apoyo incondicional durante mi formación profesional. v AGRADECIMIENTOS A la Universidad Nacional San Cristóbal de Huamanga, expreso mi profundo agradecimiento por brindarme la oportunidad de formar parte de su comunidad académica y contribuir a mi desarrollo universitario. Asimismo, manifiesto mi agradecimiento a la Facultad de Ciencias de la Salud y a la Escuela Profesional de Farmacia y Bioquímica, así como a los docentes que han sido parte fundamental en mi formación profesional. Su apoyo y enseñanza han sido clave en mi crecimiento académico. De manera especial, extiendo mi reconocimiento y agradecimiento al Dr. QF Marco R. Aronés Jara por su valioso respaldo en la realización de este trabajo de investigación. vii ÍNDICE GENERAL Página RESUMEN xv ABSTRACT xvii CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN 1 CAPITULO II. DESARROLLO DE LA PERSPECTIVA TEÓRICA 5 2.1. Marco Referencial 5 2.1.1. Antecedentes Internacionales 5 2.1.2. Antecedentes Nacionales 11 2.1.3. Antecedentes Locales 12 2.2. Marco Teórico 13 2.2.1. Cardo Mariano (Silybum marianum) 13 2.2.2. Extracción de Metabolitos S secundarios por Maceración Dinámica 18 2.2.3. Optimización de Proceso 22 2.3. Marco Conceptual 23 2.4. Marco Ético y Legal 24 CAPÍTULO III. MATERIALES Y MÉTODOS 25 3.1. Alcance de Investigación 25 3.2. Diseño de Investigación 25 3.3. Unidad de Análisis 25 3.4. Población de Estudio 26 3.5. Muestra 26 3.6. Criterios de Selección 26 3.6.1. Criterios de Inclusión 26 3.6.2. Criterios de Exclusión 26 3.7. Técnicas e Instrumentos de Recolección de Datos 26 3.7.1. Preparación de la Muestra 26 3.7.2. Obtención del Extracto Hidroalcohólico 26 3.7.3. Análisis de Contenido de Silimarina 27 3.8. Análisis de Datos 28 3.9. Consideraciones Éticas 28 CAPÍTULO IV. RESULTADOS 29 CAPÍTULO V. DISCUSIÓN 43 viii CAPÍTULO VI. CONCLUSIONES 49 CAPÍTULO VII. RECOMENDACIONES 51 BIBLIOGRAFÍA 53 ANEXOS 63 ix ÍNDICE DE TABLAS Página Tabla 1 Niveles de las variables independientes en el diseño experimental 25 Tabla 2 Condiciones experimentales y contenido de silimarina en función de la temperatura (°C) tiempo (min) y concentración de etanol (%). 31 Tabla 3 Analisis de varianza del modelo cuadrático para la optimiza ción del contenido de silimarina. 32 Tabla 4 Coeficientes codificados del modelo cuadrático para la predicción del contenido de silimarina. 33 Tabla 5 Indicadores de ajuste del modelo cuadrático para la predicción del contenido de silimarina. 34 Tabla 6 Condiciones óptimas determinadas por el optimizador de respuesta para maximizar el contenido de silimarina. 39 Tabla 7 Validacion experimental del rendimiento de silimarina en condiciones optimizadas de temperatura (°C), tiempo (min) y concentración de etanol (%). 40 xi ÍNDICE DE FIGURAS Página Figura 1 Fotografía de Silybum marianum recolectados en el distrito de Huamanguilla. 13 Figura 2 Estructuras químicas de los flavolignanos presentes en la silimarina. 16 Figura 3 Superficie de respuesta para la extracción de silimarina (%) en función de la temperatura (°C) y el tiempo (min). 35 Figura 4 Superficie de respuesta para la extracción de silimarina en función de la concentración de etanol (%) y el tiempo (min). 36 Figura 5 Superficie de respuesta para la extracción de silimarina en función de la concentración de etanol (%) y la temperatura (°C). 37 Figura 6 Diagrama de Pareto de efectos estandarizados para la extraccion de silimarina. 38 Figura 7 Barrido espectral del extracto de semillas de Silybum marianum obtenido en condiciones óptimas de temperatura (°C), tiempo (min) y concentración de etanol (%). 41 xiii ÍNDICE DE ANEXOS Página Anexo 1 Matriz de Definición y Operacionalización de Variables 64 Anexo 2 Matriz de Consistencia 65 Anexo 3 Diseño experimental Box-Behnken, reporte del peso de la muestra, absorbancia y porcentaje de silimarina por cada parámetro de extracción. 66 Anexo 4 Probabilidad normal de los residuos del modelo cuadrático para la predicción del contenido de silimarina 67 Anexo 5 Residuos frente a los valores ajustados del modelo cuadrático para la predicción del contenido de silimarina. 68 Anexo 6 Parámetros óptimos y comportamiento de los parámetros de extraccion en la obtención de silimarina por el metodo de maceración dinámica. 69 Anexo 7 Planta de cardo mariano ubicado en el distrito de quinua, a 3,396 metros sobre el nivel del mar. 70 Anexo 8 Flujograma que describe las etapas de recolección, obtención del extracto hidroalcohólico y proceso de atomización de las semillas de Silybum marianum. 71 Anexo 9 Flujograma de las etapas para la obtención del extracto hidroalcohólico de las semillas de Silybum marianum. 72 Anexo 10 Flujograma de atomización del extracto hidroalcohólico de las semillas de cardo mariano. 74 Anexo 11 Proceso de identificación del contenido de silimarina mediante espectrofotometría en el extracto atomizado de Silybum marianum. 75 xv RESUMEN Silybum marianum (cardo mariano) es una planta medicinal reconocida por su contenido de silimarina, un complejo de flavonolignanos con efectos hepatoprotectores y antioxidantes. La optimización del proceso de extracción es fundamental para mejorar la eficiencia, reproducibilidad y sostenibilidad en la obtención de este metabolito de interés farmacéutico. El objetivo del presente estudio fue optimizar la extracción hidroalcohólica de silimarina a partir de semillas recolectadas en la región Ayacucho (Perú), mediante un diseño Box-Behnken. Se evaluaron tres factores: temperatura (50- 90 °C), tiempo (60-120 min) y concentración de etanol (30-90%), empleando maceración dinámica. La cuantificación de silimarina se realizó por espectrofotometría UV-Vis a 288 nm. El modelo cuadrático fue significativo (p < 0,01), con un R² ajustado de 87,49%. La concentración de etanol fue el factor más influyente. Las condiciones óptimas determinadas fueron 50 °C, 85,45 min y 73,64% de etanol, con un rendimiento estimado de 68,55% y una deseabilidad compuesta de 0,97. La validación experimental bajo estas condiciones arrojó un contenido de silimarina equivalente al 70,87% y una integridad del compuesto cuando se realizó un barrido espectral UV-vis comparado con el estándar. En conclusión, el modelo estadístico aplicado permitió optimizar de forma efectiva el proceso de extracción, validando su aplicabilidad en la obtención eficiente y estandarizada de silimarina para uso en productos farmacéuticos, nutracéuticos o cosmecéutico. Palabras clave: Silybum marianum, silimarina, optimización de extracción, diseño Box-Behnken, maceración hidroalcohólica. xvii ABSTRACT Silybum marianum (milk thistle) is a medicinal plant recognized for its silibinin content, a flavonolignan complex with hepatoprotective and antioxidant properties. Optimizing the extraction process is essential to improve efficiency, reproducibility, and sustainability in obtaining this pharmacologically valuable metabolite. The aim of this study was to optimize the hydroalcoholic extraction of silymarin from seeds collected in the Ayacucho region (Peru) using a Box-Behnken design. Three factors were evaluated: temperature (50–90 °C), extraction time (60–120 min), and ethanol concentration (30–90%), employing dynamic maceration. Silymarin quantification was performed by UV-Vis spectrophotometry at 288 nm. The quadratic model was statistically significant (p < 0.01), with an adjusted R² of 87.49%. Ethanol concentration was identified as the most influential factor. The optimal conditions were determined as 50 °C, 85.45 min, and 73.64% ethanol, yielding an estimated silymarin content of 68.55% with a composite desirability of 0.97. Experimental validation under these conditions resulted in a silymarin yield equivalent to 70.87% and confirmed compound integrity based on UV-Vis spectral scanning compared to the standard. In conclusion, the applied statistical model effectively optimized the extraction process, validating its applicability for the efficient and standardized recovery of silymarin for use in pharmaceutical, nutraceutical, or cosmeceutical formulations. Keywords: Silybum marianum, silymarin, extraction optimization, Box- Behnken design, hydroalcoholic maceration. 1 CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN Silybum marianum, conocido como cardo mariano, según los estudios arqueológicos en el periodo Neolítico de la cuenca del Mediterránea, es una especie de uso medicinal (Marceddu et al., 2022). Desde entonces, ha sido empleado en el tratamiento de afecciones biliares, mordeduras de serpientes, rabia, hinchazón, erisipela y enfermedades del hígado (Abenavoli et al., 2018). En el distrito de Ocros de la región de Ayacucho, Silybum marianum es conocido localmente como “escorzonera” y sus hojas se utilizan con fines terapéuticos como antihemorrágico, antidiabético, fiebre, desinflamante hepático y en el tratamiento de afecciones renales (Casaverde Cisneros, 2017). Asimismo, en el distrito de Quinua se ha registrado la presencia de Silybum marianum, conocida localmente como “eskarsina” o “isqana”, cuyas hojas son empleadas tradicionalmente en el tratamiento de afecciones nerviosas como la “colerina”, mediante el consumo del zumo extraído de las mismas (Hurtado Huarcaya & Joaquina Albán, 2018). Silybum marianum contiene un complejo de flavolignanos denominado silimarina, el cual constituye el principal compuesto bioactivo responsable de sus propiedades fitoterapéuticas y farmacológicas (AbouZid et al., 2016; Albassam et al., 2017; Chambers et al., 2017; Navarro & Montilla Herrera, 2012). Este compuesto contiene una gran variedad de flavonolignanos y se presenta en mayor porcentaje en las semillas de la planta (Chambers et al., 2017; Mam & Arafa, 2019). Las semillas se consideran como la única fuente fiable para la obtención de silimarina. Actualmente, este compuesto se comercializa en diversas formas farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades hepáticas (Chantarojanasiri, 2023). Además, se le atribuyen múltiples actividades terapéuticas prometedoras, entre ellas: efecto neuroprotector (Habotta et al., 2023), actividad anticancerígena (Jo & Kim, 2023; Kohutek & Bystricky, 2023; Mao et al., 2023; Wu et al., 2023; Yassin et al., 2022), acción antipsicótica (Ain et al., 2023), efecto adyuvante en el tratamiento del acné vulgar (Kim et al., 2023), actividad cardioprotectora (Singh et al., 2023) y antiviral (Da Silva et al., 2020). 2 Un aspecto relevante en el estudio de Silybum marianum es su cultivo como planta medicinal en países como Australia, Canadá, China y diversas regiones de América del norte (OMS, 2002). En contraste, en la región Ayacucho, esta especie crece de forma silvestre, utilizándose principalmente como forraje para el ganado vacuno. Además, sus hojas son empleadas en infusión como remedio tradicional para tratar afecciones cardíacas (Aronés-Jara et al., 2025). La creciente demanda de la silimarina para la formulación de diversas formas farmacéuticas ha impulsado a la comunidad científica a desarrollar métodos eficientes para la obtención de extractos estandarizados. En este contexto, el resultado fundamental es emplear una técnica de extracción adecuada y establecer parámetros óptimos que permitan maximizar el rendimiento del compuesto, reducir el consumo de solventes, minimizando el tiempo de procesamiento y optimizar la temperatura para favorecer la solubilidad del analito. Entre estos parámetros, la temperatura, el tiempo de extracción y la concentración del solvente son los principales factores que afectan, determinan la eficiencia del proceso extractivo (Kaufmann & Christen, 2002). De acuerdo con la Farmacopea Europea, la silimarina se obtiene empleando técnicas de extracción tradicionales como soxhlet y maceración, usando solventes tóxicos y costosos como el hexano y metanol (Wianowska & Wis̈niewski, 2015). Por otro lado (Wallace et al., 2005), demostró que el agua hirviendo es un disolvente de extracción eficaz para las silimarinas más polares. En este contexto, el empleo de solventes hidroalcohólicos se perfila como una alternativa eco amigable frente a los métodos de extracciones convencionales, al ofrecer ventajas como la reducción del uso de disolventes tóxicos y la eliminación de agentes surfactantes (Bustos Zambrano, 2023). Sin embargo, para aprovechar plenamente esta alternativa, resulta necesario establecer las condiciones óptimas del proceso que garanticen una alta eficiencia en la obtención del compuesto bioactivo. En ese sentido, el problema de investigación planteado fue: ¿Cuáles son las condiciones óptimas de temperatura, tiempo de extracción y concentración de etanol que permiten maximizar el rendimiento de silimarina mediante extracción hidroalcohólica a partir de semillas de Silybum marianum de la región? Para responder a esta interrogante, se planteó como objetivo general determinar las condiciones óptimas de extracción hidroalcohólica para maximizar el rendimiento de silimarina a partir de semillas de Silybum marianum recolectadas en la región Ayacucho. Asimismo, se establecieron los siguientes objetivos específicos: 3 • Analizar el efecto de la concentración de etanol sobre el rendimiento de extracción de silimarina. • Determinar la influencia de la temperatura en el rendimiento de extracción de silimarina. • Evaluar el efecto del tiempo de extracción en el rendimiento de extracción de silimarina. • Identificar las condiciones combinadas óptimas que maximicen el rendimiento de silimarina utilizando un diseño experimental Box-Behnken. En coherencia con estos objetivos, se formuló como hipótesis de investigación se planteó que el uso de condiciones optimizadas de temperatura, tiempo de extracción y concentración de etanol mediante un diseño experimental Box-Behnken permite maximizar significativamente el rendimiento de silimarina extraída de semillas de Silybum marianum. Como resultado de esta investigación, determinó que las condiciones óptimas para la extracción de silimarina fueron una temperatura de 50 °C, un tiempo de 84,85 minutos y una concentración de etanol del 76,67%. 5 CAPITULO II. DESARROLLO DE LA PERSPECTIVA TEÓRICA 2.1. Marco Referencial 2.1.1. Antecedentes Internacionales Gilabadi et al. (2023) desarrollaron un método eficaz para la elaboración de tinturas de cardo mariano que asegure una dosis terapéutica apropiada de silimarina para el tratamiento de enfermedades hepáticas. Para ello, emplearon semillas enteras y pericarpio (entero y molido), realizando la extracción por maceración a temperatura ambiente con solución hidroalcohólica al 70% v/v en una proporción material vegetal/solvente de 1:1 y 1:2 durante 1, 3 y 7 días. El contenido total de silimarina se cuantificó por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC). Los resultados obtenidos mostraron concentraciones de 36,23 ± 6,38 mg/ml, 38,02 ± 1,44 mg/ml y 40,93 ± 1,23 mg/ml de silimarina cuando se maceraron semillas enteras molidas, pericarpios enteros y molidos durante siete días con una proporción de material vegetal a solvente de 1:1. No se observaron diferencias estadísticamente significativas. En conclusión, las extracciones de siete días alcanzaron concentraciones de silimarina acordes con el contenido recomendado de ingrediente activo de al menos 25 mg/ml. Doostkam et al. (2022) estudiaron la actividad hepatoprotectora y los posibles mecanismos de acción del Silybum marianum y Cynara scolymus (alcachofa). Para ello, establecieron la enfermedad del hígado graso no alcohólico en ratas tras cuatro semanas de inducción de diabetes tipo 2 y administraron extractos de cardo mariano y alcachofa durante ocho semanas. Evaluaron la tolerancia oral a la glucosa, el estrés oxidativo sérico, los exámenes funcionales hepáticos y el perfil lipídico. La terapia con ambas preparaciones no mejoró significativamente la tolerancia a la glucosa en ratas diabéticas, pero sí aumentó la actividad del superóxido dismutasa sérica y redujo los niveles de malondialdehído. Además, el cardo mariano disminuyó significativamente la actividad sérica del aspartato aminotransferasa, así como los niveles de triglicéridos, colesterol total y colesterol de lipoproteínas de baja densidad, mientras que la alcachofa sólo redujo los niveles de triglicéridos. Histológicamente, el cardo mariano mostró una protección efectiva contra los cambios patológicos hepáticos. En conclusión, el cardo mariano podría constituir una opción farmacológica prometedora para tratar la 6 enfermedad del hígado graso no alcohólico, por lo que se recomienda realizar estudios clínicos aleatorizados a largo plazo para confirmar estos hallazgos. Mohamed Najim et al. (2022) evaluaron la propiedad hepatoprotectora de una formulación farmacéutica basada en cardo mariano en ratas albinas hembras diabéticas. Se dividieron en cuatro grupos (n = 8): dos controles sanos (con y sin tratamiento) y dos grupos diabéticos (con y sin tratamiento). Se administró vía oral 200 mg/kg/día del formulado de cardo mariano a los grupos tratados y se recogieron muestras de sangre al inicio y tras cuatro semanas de tratamiento. Las funciones hepáticas se evaluaron mediante la medición de enzimas hepáticas. Los resultados indicaron que el consumo diario del formulado logró el objetivo terapéutico, previniendo la degeneración de las células hepáticas inducida por la diabetes. Microscópicamente, se confirmó la restauración de las células hepáticas. Además, el tratamiento redujo significativamente los niveles de glucosa basal en ratas diabéticas. En conclusión, el cardo mariano presenta un efecto hepatoprotector, restaurador de células hepáticas dañadas y es prometedor para el uso profiláctico contra complicaciones de la diabetes. Yassin et al. (2022) investigaron la eficacia anticancerígena del extracto total de Silybum marianum, la silimarina y la Silibinina contra el carcinoma hepatocelular inducido experimentalmente en ratas. Para la inducción del carcinoma hepatocelular, se administró dietilnitrosamina, 2-acetilaminofluoreno y tetracloruro de carbono durante 25 semanas, mientras que, en paralelo, se suministraron tratamientos orales de Silybum marianum (200 mg/kg de peso corporal), silimarina (150 mg/kg) y Silibinina (5 mg/kg) en días alternos. Los tres tratamientos inhibieron el crecimiento de las lesiones cancerosas. Abdallah et al. (2022) investigaron el desarrollo de nuevas formas farmacéuticas a partir de productos naturales, centrándose en la silimarina por su actividad hipoglucemiante. Debido a su limitada solubilidad y absorción enteral, se optó por una formulación tópica en gel transfersomal. Mediante un diseño Box- Behnken, se evaluaron 15 formulaciones con tres variables independientes (tiempo de sonicación, concentración de fosfolípidos y surfactante) y dos variables dependientes (liberación in vitro y eficiencia de encapsulación). La formulación optimizada, incorporada en gel de hidroxipropilmetilcelulosa, presentó un pH de 7,05, viscosidad de 6,27 Pa y capacidad de extensión de 55,35 mm. Además, mostró el mayor flujo transdérmico (92,41 µg/cm².h) y redujo significativamente la glucosa en sangre en modelos in vivo, superando la eficacia del gel de silimarina y la suspensión oral. Estos 7 hallazgos sugieren que el gel transfersomal es un vehículo prometedor para la administración transdérmica de silimarina. Abderrezag et al. (2022) investigaron la aplicación de la extracción líquida expandida con gas (GXL) para concentrar la fracción de flavonolignanos, específicamente silimarina y taxifolina, a partir de semillas de Silybum marianum. Se empleó etanol acuoso en concentraciones del 20%, 50% y 80% (v/v) en combinación con diferentes proporciones de CO₂/líquido (25%, 50% y 75%). Los extractos obtenidos fueron caracterizados química y funcionalmente mediante cromatografía líquida de ultra alta eficiencia acoplada a espectrometría de masas en tándem con ionización por electropulverización (UHPLC-ESI-MS/MS) y evaluados por ensayos in vitro de actividad antiinflamatoria, anticolinérgica y antioxidante. Los resultados indicaron que la mejor eficiencia de extracción (55,97%) se obtuvo utilizando una mezcla ternaria de solventes compuesta por CO₂:EtOH:H₂O (25:60:15) a 40 °C y 9 MPa durante 160 minutos. Además, los extractos mostraron una actividad antioxidante y antiinflamatoria significativa, con valores de IC₅₀ de 8,80 µg/ml y 28,52 µg/mL, respectivamente, mientras que la actividad anticolinesterasa fue moderada, con un valor de IC₅₀ de 125,09 µg/ml. Se determinó que la concentración de silimarina en el extracto alcanzó hasta un 59,6% mediante este método de extracción en un solo paso sin necesidad de purificación adicional, siendo la silibina A+B el compuesto predominante con una concentración de 545,73 mg/g de extracto. Nekkaa et al. (2021) optimizaron el rendimiento de extracción del contenido total de flavonoides (TFC) y del contenido total de polifenoles (TPC) a partir de hojas de Rhamnus alaternus mediante un diseño Box-Behnken de 15 corridas. Con el objetivo de evaluar la capacidad antioxidante a través del ensayo de 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH), se optimizó el procedimiento de maceración dinámica para la extracción de TPC y TFC. El estudio analizó y optimizó la relación entre la velocidad de agitación, el tiempo de extracción y la proporción material vegetal-disolvente con el fin de obtener extractos ricos en compuestos fenólicos. Los parámetros óptimos de extracción se determinaron en una velocidad de agitación de 518 rpm, un tiempo de extracción de 24 horas y una relación disolvente-sólido de 10:1 mg/g, con un valor de deseabilidad de 0,970. La optimización de la maceración dinámica permitió la obtención de extractos con altos contenidos de polifenoles y flavonoides totales, alcanzando valores experimentales de 230,9 mg de equivalentes de ácido gálico por gramo de extracto (mg GAE/g) y 121,1 mg de equivalentes de quercetina por gramo de extracto (mg QE/g), 8 respectivamente, con un valor de IC₅₀ de 22,5 µg/ml, en concordancia con los modelos matemáticos obtenidos. Valková et al. (2020) realizaron una revisión sistemática sobre Silybum marianum y su potencial aplicación en el ámbito farmacéutico y medicinal. A partir de estudios in vitro, in vivo y ensayos clínicos, se identificó que la silimarina posee diversas propiedades terapéuticas, incluyendo efectos hepatoprotectores, anticancerígenos, antiinflamatorios, inmunomoduladores, neuroprotectores y lactogénicos. Sin embargo, el mecanismo de acción de esta molécula aún no se comprende completamente, por lo que se requiere la realización de estudios adicionales para su elucidación. Azadpour et al. (2020) investigaron la actividad antioxidante y anticancerígena de la silimarina extraída de semillas de Silybum marianum en líneas celulares KB y A549 tras diferentes tiempos de tratamiento. Para su obtención, las semillas fueron desgrasadas con n-hexano durante seis horas y posteriormente extraídas con metanol. La composición de la silimarina se analizó mediante cromatografía líquida de alta resolución, evidenciando que más del 50% de los compuestos correspondían a silibina A y B. La capacidad antioxidante se determinó mediante el método de DPPH, mostrando una concentración inhibitoria media del 50% (IC₅₀) de 6,56 µg/ml, en comparación con el hidroxitolueno butilado (BHT), cuyo IC₅₀ fue de 3,9 µg/ml. La actividad anticancerígena, evaluada con el ensayo MTT, mostró una citotoxicidad del 80% en KB y 70% en A549 a concentraciones específicas. En conclusión, los resultados evidencian que la silimarina posee un alto potencial antioxidante y anticancerígeno, lo que sugiere su posible aplicación en el desarrollo de fármacos contra el cáncer. Drouet et al. (2019) optimizaron la extracción asistida por ultrasonido de los flavolignanos de la silimarina utilizando etanol acuoso como solvente. Para ello, identificaron cinco factores independientes: tiempo de extracción, concentración del solvente, frecuencia de ultrasonido, temperatura de extracción y proporción muestra- solvente. A partir de ensayos preliminares de un solo factor, seleccionaron las variables que influyeron significativamente en la extracción de la silimarina, siendo estas la concentración de etanol, la frecuencia de ultrasonido y el tiempo de extracción. Para la optimización del proceso, se empleó un diseño factorial completo, manteniendo constantes la temperatura de extracción a 45 °C y la relación muestra/solvente en 1:25 g/mL. Los parámetros óptimos de extracción determinados fueron: etanol acuoso al 54,5% (v/v), frecuencia de ultrasonido de 36,6 kHz y tiempo de extracción de 60 9 minutos. Bajo estas condiciones, el rendimiento de extracción de la silimarina fue de 20,28 ± 0,41 mg/g de peso seco. En conclusión, las condiciones optimizadas en esta investigación proporcionan un método eficiente y respetuoso con el medio ambiente para obtener extractos con actividad antioxidante y antienvejecimiento, con potencial aplicación en formulaciones farmacéuticas. Hajiaghaee et al. (2018) investigaron los procedimientos de desengrasado y el uso de diferentes solventes en la extracción de silimarina a partir de semillas de Silybum marianum. Para ello, emplearon el método de extracción a reflujo durante seis horas a una temperatura de 60 °C, utilizando diferentes materias primas: semillas molidas, harina desengrasada con solventes, harina desengrasada prensada en frío y pericarpios separados. Asimismo, evaluaron tres disolventes: metanol puro, metanol al 80% y etanol al 80%. Los extractos obtenidos fueron pesados y analizados mediante cromatografía líquida de alta eficiencia para la cuantificación de los compuestos de silimarina. Los resultados indicaron que el extracto metanólico de semillas molidas presentó la mayor cantidad de silimarina, mientras que el extracto etanólico al 80% obtenido del pericarpio separado mostró la mayor concentración de este compuesto. En conclusión, la elección del material vegetal y del disolvente influye significativamente en el rendimiento y la concentración de silimarina extraída, lo que puede ser relevante para futuras aplicaciones farmacéuticas. Ruan et al. (2018) optimizaron las condiciones de extracción de silimarina a partir de pajuelas de Silybum marianum mediante extracción asistida por microondas, empleando la metodología de superficie de respuesta (RSM) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Los resultados indicaron que las condiciones óptimas para maximizar el rendimiento de silimarina fueron una potencia de microondas de 146 W, un tiempo de extracción de 117 segundos, una relación líquido-sólido de 16:1 mL/g y una concentración de etanol del 43% (v/v). Las pruebas de validación demostraron que, bajo estas condiciones optimizadas, el rendimiento real de silimarina fue de 6,83 ± 0,57 mg/g, con una desviación estándar relativa del 0,92% (n = 5). Jahan et al. (2016) evaluaron distintos métodos de extracción de silimarina a partir de semillas de Silybum marianum, empleando las técnicas de reflujo, Soxhlet, maceración y extracción asistida por microondas con diferentes disolventes. Los resultados indicaron que la extracción mediante Soxhlet y la extracción asistida por microondas fueron las técnicas más eficientes en comparación con las demás. Además, tanto la cuantificación espectrofotométrica como la cromatografía líquida de alta 10 resolución (HPLC) revelaron que los mayores contenidos de silimarina se obtuvieron en los extractos preparados con metanol utilizando la extracción asistida por microondas, seguida por la técnica de Soxhlet. Saleh et al. (2015) investigaron la influencia del tamaño de partícula en la composición y el rendimiento de la extracción de silimarina a partir de los frutos de Silybum marianum. Para ello, emplearon dos métodos de molienda: un molino de bolas, que generó partículas de 30 a 200 nm, y una licuadora que produjo partículas de 300 a 700 μm. La extracción se realizó mediante ultrasonido asistido utilizando metanol al 80% como disolvente. Los resultados mostraron que el rendimiento de extracción fue del 10% para las partículas obtenidas con el molino de bolas y del 8,5% para las partículas obtenidas con la licuadora. En cuanto a la composición, el extracto con partículas de menor tamaño presentó un mayor porcentaje de silicristina, silidianina, silibina A, silibina B e iso-silibina B, mientras que la concentración de taxifolina e iso- silibina A se redujo en comparación con las semillas molidas con la licuadora. Estos hallazgos demuestran que el tamaño de partícula influye significativamente en el rendimiento y la composición de la silimarina extraída, lo que puede ser determinante en su aplicación farmacéutica. Liu et al. (2009) optimizaron la extracción asistida por enzimas de silibina a partir de semillas de Silybum marianum mediante un diseño experimental Box- Behnken, con el objetivo de mejorar el rendimiento de extracción con el apoyo de una matriz ortogonal. Se evaluaron tres factores: el pH de la solución enzimática (PES), la temperatura de incubación de la enzima (EIT) y el tamaño de las semillas (SS), cuyos efectos sobre el rendimiento de silibina fueron analizados a través de gráficos tridimensionales de superficie de respuesta y contorno. Los parámetros óptimos de enzimólisis fueron una EIT de 40 °C, un SS de 7003 μm y un PES de 4,5 logrando un rendimiento predictivo de 24,6 mg/g en semillas desengrasadas, con un coeficiente de determinación (R²) superior a 0,97 (n = 15). La productividad real de silibina fue de 24,81 ± 1,93 mg/g, lo que representó un aumento del 138% y 123,6% en comparación con la extracción con etanol en esta investigación. La espectroscopia infrarroja y la cromatografía líquida de alta eficiencia del extracto obtenido mediante extracción asistida por enzimas (EAE) mostraron similitudes con los resultados de la extracción con etanol. Además, las imágenes obtenidas mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía electrónica de transmisión (TEM) evidenciaron que la 11 extracción de silibina depende en gran medida de la destrucción de las paredes celulares. Wallace et al. (2005) compararon la extracción de silimarina a partir de semillas de Silybum marianum, tanto desgrasadas como enteras, utilizando diversos disolventes en función de la temperatura. Además, investigaron la extracción con agua a 50, 70 y 85 °C, observando que la productividad de silimarina aumentó con el incremento de la temperatura del agua. En términos generales, el etanol a 60 °C permitió recuperar mayores cantidades de silimarina. No obstante, el agua hirviendo demostró ser un disolvente eficaz para la extracción de silimarinas más polares, como la silicristina y la taxifolina, incluso cuando se emplearon semillas enteras. Al utilizar semillas molidas desgrasadas y extraerlas con etanol hirviendo, se obtuvieron rendimientos máximos de 6,86 mg/g de silibinina B, 0,62 mg/g de taxifolina, 4,04 mg/g de silibinina A y 3,89 mg/g de silicristina. En comparación, los rendimientos obtenidos al emplear semillas enteras fueron de 1,7 mg/g de silibinina A, 1,6 mg/g de silibinina B, 6,8 mg/g de taxifolina y 0,95 mg/g de silicristina. Los resultados indicaron que la extracción con etanol en semillas molidas desgrasadas produjo mayores rendimientos en comparación con las semillas enteras. Sin embargo, al utilizar agua hirviendo, los rendimientos de silibinina A, silibinina B y silicristina fueron superiores en un 47%, 50% y 380%, respectivamente, en semillas enteras en comparación con semillas desgrasadas. Esto sugiere que la selección del disolvente y el estado físico de las semillas son factores determinantes en la eficiencia de extracción de los compuestos bioactivos de Silybum marianum. 2.1.2. Antecedentes Nacionales Juárez Espinoza & Rivera Castro (2019) evaluaron el efecto de la silimarina sobre el perfil hepático y la producción de leche en vacas Holstein en alta producción en el Establo Lechero GESA S.A.C., Lambayeque. Se midieron las transaminasas aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT), así como la producción de leche antes, durante y después del tratamiento con diferentes dosis de silimarina. Los resultados mostraron que los niveles de AST y ALT se mantuvieron dentro de los rangos normales, mientras que la producción de leche aumentó en los grupos tratados, siendo más notable en el grupo que recibió 40 ml (3,2 g) de silimarina. Se concluye que esta dosis podría ser adecuada para vacas en alta producción con afectaciones hepáticas. 12 2.1.3. Antecedentes Locales Aronés-Jara et al. (2025) determinaron el contenido de silimarina en semillas de poblaciones de Silybum marianum provenientes de la región de Ayacucho. Las semillas fueron recolectadas en los distritos de Quinua, Acos Vinchos y Socos, pertenecientes a la provincia de Huamanga. Para la extracción de la silimarina, se empleó el método de extracción acelerada con solventes (ASE 150), utilizando acetona como disolvente. La identificación de la silimarina se realizó a una longitud de onda de 288 nm y mediante análisis de espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR). Los resultados mostraron que el extracto seco obtenido presentó un color amarillo con aspecto cristalino, con una similitud superior al 70% en la identificación por FT-IR. Se encontró que las semillas del distrito de Acos Vinchos contenían el mayor porcentaje de silimarina en su extracto (75,2 ± 1,9%; p < 0,05). Asimismo, el extracto seco de semillas del distrito de Quinua presentó el mayor contenido de fenoles totales (60,6 ± 0,2 mg GAE/g) y flavonoides (16,7 mg RUE/g). Los extractos evaluados mostraron actividad antioxidante proporcional a su contenido de fenoles totales (r = 0,963), y se identificó la presencia de siete flavonolignanos. En conclusión, la composición química y la actividad antioxidante de las semillas de Silybum marianum varían en función del distrito de recolección dentro de la región de Ayacucho. Hurtado Huarcaya & Joaquina Albán (2018) llevaron a cabo un estudio sobre el uso, conocimiento tradicional y difusión de la vegetación indígena en ocho comunidades campesinas andinas del distrito de Quinua. La metodología empleada incluyó la recolección de flora natural utilizada por los pobladores, así como entrevistas abiertas y semiestructuradas. Los resultados revelaron el uso de 137 especies vegetales, pertenecientes a 49 familias y 101 géneros. Las familias con mayor número de especies registradas fueron Asteraceae (34 especies), Poaceae (11 especies) y Fabaceae (9 especies). Se evidenció que los habitantes del área de estudio mantienen el conocimiento tradicional sobre sus recursos vegetales, lo cual se refleja en la diversidad de especies utilizadas, especialmente aquellas con propiedades medicinales dentro de la familia Asteraceae. Entre estas especies se identificó el Silybum marianum, conocido localmente como “isqana” y “eskarsina”, cuya aplicación tradicional del zumo extraído de sus hojas está relacionada con afecciones nerviosas, en particular para tratar la "colerina". 13 2.2. Marco Teórico 2.2.1. Cardo Mariano (Silybum marianum) La especie fue establecida y descrita originalmente por (Carlos Linneo, 1753) bajo la denominación de Carduus marianus en su obra Species Plantarum. Posteriormente, Gaertner (1788) la reclasificó dentro del género Silybum, publicando su descripción en De Fructibus et Seminibus Plantarum. 2.2.1.1. Clasificación Taxonómica de Silybum marianum “Cardo Mariano”. Según el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA), la clasificación taxonómica de Silybum marianum es la siguiente (Polanco Polanco & Pérez De Leon, 2012): Nombre común: Cardo mariano Nombre científico: Silybum marianum Reino: Plantae División: Magnoliophyta Subclase: Asteridae Orden: Asterales Familia: Asteraceae Género: Silybum Especie: Silybum marianum Sinonimias: Carduus marianus L. Nombres comunes: Esta especie es conocida con diversas denominaciones según la región, entre ellas: cardo de maría, cardo asnal, cardo lechero, cardo blanco, cardo mariano, cardo santo, isqana y eskarsina (Hurtado-Huarcaya et al., 2021). Figura 1 Fotografía de Silybum marianum recolectados en el distrito de Huamanguilla 14 2.2.1.2. Descripción Botánica. Cardo mariano es una planta anual o bienal perteneciente a la familia Asteraceae, ampliamente reconocido por sus propiedades terapéuticas. Presenta tallos erectos, robustos y ramificados, de color verde oscuro brillante, con venas de tonalidad lechoso. Su altura varía entre 20 y 150 cm, y su superficie es ligeramente aracnoide (Abenavoli et al., 2018; Polanco Polanco & Pérez De Leon, 2012). Las hojas son de forma oblonga a elíptica, pinnatífidas, con una longitud de 30 a 50 cm y un ancho aproximado de 24 cm. Son verdes, sin pecíolo, y en el haz presenta manchas blancas a lo largo de las nervaduras. Sus márgenes son ondulados y dentados, con espinas amarillas prominentes en los ápices. Las hojas inferiores son caulinares, sésiles y profundamente lobuladas, mientras que las superiores son enteras y abrazan el tallo mediante dos estípulas redondeadas y espinosas (Polanco Polanco & Pérez De Leon, 2012). Las flores, de un llamativo color púrpura, son tubulares y se agrupan en capítulos esféricos de aproximadamente 6 cm de diámetro, aunque pueden alcanzar hasta 10 cm. Estos capítulos son terminales y solitarios, con brácteas recurvadas, glabras y de márgenes espinosos, cuyo ápice culmina en una espina gruesa y afilada(Polanco Polanco & Pérez De Leon, 2012). Los frutos son aquenios de forma oblonga, con dimensiones de 0,6 a 0,8 cm de largo y 0,3 a 0,4 cm de ancho, con un grosor de 0,1 a 0,15 cm. Presentan un color café oscuro brillante con líneas delgadas más claras a lo largo de su superficie. En el extremo superior, poseen una protuberancia cartilaginosa y anular de color amarillento, acompañada de un vilano compuesto por aproximadamente 100 cerdas blanquecinas, de longitudes desiguales entre 1,2 y 2,0 cm. Los frutos son inodoros y poseen un sabor aceitoso y amargo (Fonnegra & Jiménez, 2007; Polanco Polanco & Pérez De Leon, 2012). Estos frutos contienen la silimarina en una proporción del 1,3 al 3%, la cual es una mezcla compleja de flavonolignanos con importantes propiedades fitoterapéuticas y farmacológicas (Cabello Vallejo, 2019). 2.2.1.3. Distribución Geográfica. El cardo mariano es una especie originaria de la región mediterránea, aunque con el tiempo se ha expandido a lo largo de Europa, América del Norte, el sur de Rusia, el norte de África y Asia. Actualmente, su presencia se ha extendido a nivel mundial, consolidándose como una planta de interés tanto medicinal como ornamental, especialmente en Europa y Asia (Giuliani et al., 2018; 15 OMS, 2002; Polanco Polanco & Pérez De Leon, 2012; Wianowska & Wis̈niewski, 2015). En el ámbito comercial, el cardo mariano se encuentra entre los productos herbarios más vendidos en países como Estados Unidos, en Italia y otras naciones con una fuerte tradición en el uso de plantas medicinales (Giuliani et al., 2018). Su crecimiento se da en terrenos secos, rocosos y despejados, siendo común encontrarlo en los bordes de carreteras y zonas de baja intervención agrícola (Aronés-Jara et al., 2025; Fonnegra & Jiménez, 2007). En la región Ayacucho, Perú, estudios etnobotánicos han identificado al Silybum marianum como una especie silvestre con un uso limitado en la medicina tradicional. Su presencia ha sido registrada en los distritos de Quinua, Acosvinchos y Ocros, donde crece de manera espontánea en suelos no cultivados (Aronés-Jara et al., 2025; Casaverde Cisneros, 2017; Hurtado Huarcaya & Joaquina Albán, 2018). 2.2.1.4. Usos Tradicionales. El empleo del cardo mariano en la medicina tradicional se remonta a hace más de 2000 años, siendo reportado por primera vez por Teofrasto, quien destacó su efecto hepatoprotector (Giuliani et al., 2018). En Europa, durante el siglo I, los romanos lo utilizaban para tratar enfermedades hepáticas, y con el paso del tiempo su uso se ha expandido ampliamente. En la actualidad, la decocción de sus semillas se emplea como laxante, digestivo, antineoplásico, antiinflamatorio, diurético, hipotensor y astringente. Un hito importante en su estudio ocurrió en 1960, cuando se logró aislar la silimarina, el principal compuesto bioactivo del cardo mariano (Polanco Polanco & Pérez De Leon, 2012). Por otro lado, las hojas de Silybum marianum han sido tradicionalmente utilizadas como estimulante en trastornos funcionales de la vesícula biliar, hígado, bazo y útero, así como en el tratamiento de esplenopatías y metropatías. También se le ha atribuido un papel en el tratamiento de la malaria, además de sus propiedades emenagogas, febrífugas y su utilidad en afecciones uterinas, respiratorias, hipotensión y leucorrea (Polanco Polanco & Pérez De Leon, 2012). En la región de Ayacucho, el Silybum marianum es conocido localmente como “isqana” y “eskarsina”, y es empleado por los comuneros en el tratamiento de afecciones nerviosas, en particular la denominada “colerina”. Para este propósito, se bebe el zumo extraído de sus hojas, aprovechando sus propiedades terapéuticas (Hurtado-Huarcaya et al., 2021). 16 2.2.1.5. Composición Química. Las semillas de cardo mariano contienen una variedad de compuestos bioactivos que contribuyen a sus propiedades terapéuticas. A continuación, se detallan los principales componentes químicos presentes en las semillas: Flavolignanos. La silimarina es el principal complejo bioactivo presente en las semillas, representando aproximadamente entre el 1,3% y el 3% de su peso. Este complejo es resultante de la combinación del alcohol coniferílico y la taxifolina (Cobos Quiroz, 2022). Los principales flavonolignanos de la silimarina son: silibina, silicristina y silidianina (Castillo Jaramillo, 2018). Además, se han identificado sus desoxiderivados, así como isosilibina A e isosilicristina (Abouzid et al., 2016; Castillo Jaramillo, 2018). A continuación, se muestran las estructuras moleculares de los flavonolignanos que forman parte de la silimarina. Figura 2 Estructuras químicas de los flavolignanos presentes en la silimarina 17 Flavonoides. Además de los flavonolignanos, las semillas contienen flavonoides como la taxifolina, quercetina, apigenina, naringina y eridictiol; que contribuyen a sus propiedades antioxidantes (Castillo Jaramillo, 2018; Gómez Peredo, 2017). Ácidos Grasos. Contiene entre un 20 a 35% de ácidos grasos, entre los que destacan: ácido linoleico, oleico, palmítico, esteárico y mirístico (Castillo Jaramillo, 2018). Proteínas. Las semillas contienen proteínas de alta calidad, entre las que destacan aminoácidos esenciales como la lisina, metionina y arginina (Gómez Peredo, 2017). Otros Compuestos. Destacan alto contenido de fibra dietética, mucílagos, tocoferoles, esteroles vegetales y minerales como potasio, calcio, magnesio y hierro (Gómez Peredo, 2017). 2.2.1.6. Propiedades Farmacológicas. La silimarina ha demostrado una notable eficacia en el tratamiento y prevención de diversas enfermedades, gracias a su amplio espectro de propiedades terapéuticas. Entre sus efectos más relevantes se destacan sus acciones antiinflamatorias, antifibrótica e inmunomoduladores (Abenavoli et al., 2010). Asimismo, se ha evidenciado su utilidad en el manejo de trastornos hepáticos, cirrosis, hepatitis crónica y cálculos biliares. Además, posee propiedades antimicrobianas, anticancerígenas, y antivirales, así como efectos beneficiosos en el control del hipercolesterolemia, la diabetes y el estrés oxidativo (Ain et al., 2023; Chantarojanasiri, 2023; Da Silva et al., 2020; Habotta et al., 2023; Jo & Kim, 2023; Kim et al., 2023; Kohutek & Bystricky, 2023; Mao et al., 2023; Singh et al., 2023; Wu et al., 2023; Yassin et al., 2022). Por otro lado, investigaciones recientes han revelado que el cardo mariano, fuente natural de silimarina, ejerce una función protectora frente a agentes tóxicos, atribuida a su capacidad para eliminar radicales libres, quelar metales pesados y regular los procesos inflamatorios (Fanoudi et al., 2018). Sus propiedades antioxidantes y antiapoptóticas lo convierten en un aliado en la prevención del daño celular. Además, se ha identificado su actividad fotoprotectora sobre la piel y su potencial quimiopreventivo frente a la carcinogénesis, incluida la fotoinducida (Vaid & Katiyar, 2010; Vostálová et al., 2019). Estudios también sugieren su eficacia en la retinopatía diabética, lo que refuerza su papel como un compuesto con amplias aplicaciones terapéuticas en el ámbito de la salud (García Ramírez et al., 2018; Karimi et al., 2022). 18 2.2.2. Extracción de Metabolitos Secundarios por Maceración Dinámica La extracción por maceración dinámica en rotavapor es una técnica utilizada en la extracción de compuestos bioactivos de materiales vegetales (Nekkaa et al., 2021). Esta técnica combina la maceración, que es el proceso de permitir que un solvente actúe sobre el material vegetal durante un tiempo prolongado, con el uso de un rotavapor sin vacío para facilitar el acondicionamiento de la temperatura y la rotación que permite la agitación constante. El volumen del extracto obtenido se concentra usando un rotavapor a presión reducida y se almacena en refrigeración (Figueroa & Diaz, 2016). La extracción de metabolitos secundarios de plantas es un proceso complejo y multifactorial que requiere la optimización de las condiciones de extracción para maximizar el rendimiento y la pureza de los compuestos de interés (Nekkaa et al., 2021). A continuación, se detallan las condiciones de extracción: 2.2.2.1. Efecto de Temperatura en la Extracción. La temperatura es un factor crítico en la extracción de metabolitos de las plantas, afectando diversos aspectos del proceso que pueden influir en la cantidad y calidad de los metabolitos extraídos. A continuación, se desarrolla las principales maneras en que la temperatura influye en la extracción de estos compuestos: Solubilidad de los Metabolitos. En general, el incremento de la temperatura aumenta la solubilidad de muchos metabolitos en el solvente de extracción. Esto se debe a que el aumento de la temperatura incrementa la energía cinética de las moléculas, facilitando la disolución de los solutos en el solvente. Los compuestos polares, como los glucósidos y ciertos ácidos fenólicos, a menudo tienen una solubilidad mejorada en solventes acuosos a temperaturas más altas (Mason & Peters, 2003).Reducción de la Viscosidad. A medida que la temperatura aumenta, la viscosidad del solvente disminuye. Esto facilita una mejor penetración y difusión del solvente en el material vegetal, lo que puede mejorar la extracción de metabolitos (Jovanović et al., 2017; Oroian et al., 2020). Aceleración de Difusión de los Metabolitos. El aumento de la temperatura incrementa la energía cinética de las moléculas tanto en el solvente como en el material vegetal, acelerando la difusión de los metabolitos desde el interior de las células vegetales hacia el solvente. Esto puede acelerar el proceso de extracción y reducir el tiempo necesario para obtener un extracto con una alta concentración de metabolitos (Basilio-Cortes et al., 2023; Jovanović et al., 2017; Oroian et al., 2020). 19 Descomposición Térmica de los Metabolitos. Las temperaturas elevadas pueden causar la descomposición o degradación de ciertos metabolitos. Por ejemplo, compuestos volátiles, terpenos y algunos flavonoides pueden ser sensibles al calor y perderse durante la extracción. Es crucial controlar la temperatura para evitar la descomposición de metabolitos delicados, lo que puede afectar la calidad del extracto (Basilio-Cortes et al., 2023; Jovanović et al., 2017; Oroian et al., 2020). Aumento de la Velocidad de Extracción. La temperatura más alta generalmente aumenta la tasa de extracción, reduciendo el tiempo necesario para obtener los metabolitos deseados. Sin embargo, esto debe equilibrarse con el riesgo de degradación de los compuestos sensibles. Por ello, el proceso de optimización es muy importante. Ajustar la temperatura para maximizar la velocidad de extracción sin comprometer la integridad de los metabolitos es esencial para un proceso eficiente (Basilio-Cortes et al., 2023; Jovanović et al., 2017; Oroian et al., 2020). 2.2.2.2. Efecto del Tiempo en la Extracción. El tiempo es un factor esencial en la extracción de metabolitos secundarios, ya que afecta directamente la cantidad, calidad y eficiencia del proceso de extracción. A continuación, se detallan los principales efectos del tiempo en este proceso: Mayor tiempo, Mayor Difusión y Solubilización. Un tiempo de extracción prologado permite que los metabolitos secundarios se difundan desde las células del material vegetal hacia el solvente. El aumento de tiempo puede mejorar la cantidad de compuestos extraídos, ya que les da más oportunidad de disolverse en el medio (Palma & Taylor, 1999). Degradación de Metabolitos. Aunque tiempos prolongados pueden incrementar el rendimiento, algunos metabolitos secundarios son sensibles al calor, la luz o el oxígeno, lo que puede llevar a la degradación de los compuestos si el tiempo de extracción es excesivo. Metabolitos como los flavonoides, polifenoles o alcaloides pueden perder su actividad biológica si son expuestos demasiado tiempo a condiciones desfavorables durante la extracción (Palma & Taylor, 1999; Stalikas, 2007). Selectividad del Proceso. El tiempo también puede afectar la selectividad de la extracción. Un tiempo más corto puede resultar en la extracción preferencial de ciertos metabolitos, mientras que tiempos prolongados pueden llevar a la extracción de una mayor diversidad de compuestos, incluyendo aquellos no deseados.(Dong et al., 2010) 20 Rendimiento y Eficiencia de Extracción. Tiempos óptimos de extracción se determinan experimentalmente, buscando maximizar el rendimiento de los metabolitos sin sobrepasar el punto donde se comienza a degradar o extraer compuestos no deseados. En algunos casos, después de cierto tiempo, el incremento en la cantidad de metabolitos extraídos es insignificante, lo que indica que el proceso ha alcanzado un punto de saturación (Azmir et al., 2013; Wang & Weller, 2006). Cinética de la Extracción. Durante el proceso, se suelen observa una fase rápida inicial donde se extraen los metabolitos más accesibles, seguida de una fase más lenta donde los metabolitos más difíciles de extraer son liberados. El tiempo afecta la tasa de extracción en ambas fases (Wang & Weller, 2006). El tiempo de extracción es un balance entre permitir una completa difusión y disolución de los metabolitos secundarios y evitar la degradación de los compuestos sensibles. Un tiempo óptimo depende del tipo de metabolito, el disolvente y el método de extracción (Wang & Weller, 2006). 2.2.2.3. Efecto del Solvente en la Extracción. El solvente juega un papel crucial en la extracción de metabolitos secundarios, ya que la eficacia del proceso depende en gran medida de las propiedades fisicoquímicas del solvente y del tipo de metabolito que se desea extraer (Kumar et al., 2013). A continuación, se detallan algunos factores importantes sobre cómo el solvente afecta la extracción Polaridad del Solvente. Debe ser compatible con la naturaleza del metabolito. Los metabolitos secundarios pueden ser polares (agua, etanol) y extraen compuestos polares como flavonoides, fenoles y glicósidos; solventes semipolares (metanol, acetona) son adecuados para metabolitos con una polaridad intermedia como algunos alcaloides y terpenoides; y solventes no polares (hexano, éter de petróleo) que se usan para extraer compuestos no polares como aceites esenciales, lípidos y ciertos terpenos (Stalikas, 2007). Selectividad. Cada solvente tiene una afinidad diferente por distintos metabolitos. Esto afecta su capacidad para disolver y extraer compuestos específicos sin arrastrar otros. Por ejemplo, el etanol es un buen solvente para extraer polifenoles, pero puede no ser ideal para compuestos muy apolares (Kumar et al., 2013). Toxicidad y Compatibilidad. Es importante considerar la toxicidad del solvente, especialmente si los extractos se usarán en productos para el consumo humano. Solventes como el metanol son efectivos, pero tóxicos. Solventes más seguros, como 21 el etanol o el agua, suelen preferirse para aplicaciones alimenticias o farmacéuticas (Sasidharan et al., 2011). Capacidad de Penetración. Solventes más volátiles o con una baja viscosidad pueden penetrar más fácilmente en las células vegetales, facilitando la disolución de metabolitos. Sin embargo, algunos metabolitos pueden requerir solventes con una mayor capacidad de hinchamiento del material vegetal (Kumar et al., 2013). Eficiencia de Extracción. La combinación de diferentes solventes (como mezclas de etanol y agua) puede aumentar la eficiencia de la extracción al abarcar un rango más amplio de metabolitos secundarios (Azwanida, 2015). Temperatura y Tiempo de Extracción. Algunos solventes son más efectivos altas temperaturas, ya que la solubilidad de los metabolitos aumenta, lo que puede mejorar la extracción. Sin embargo, temperaturas elevadas pueden degradar metabolitos sensibles al calor (Kumar et al., 2013). Por tanto, la elección del solvente adecuado es esencial para maximizar la extracción de los metabolitos secundarios deseados y minimizar la extracción de compuestos indeseables o la degradación del material (Azwanida, 2015; Kumar et al., 2013). Descripción del Solvente Usado en el Proceso de Extracción de Silimarina. El disolvente empleado es una sustancia liquida que tiene la capacidad de disolver gases, solidos o líquidos. Lo cual permite la disolución de un soluto, separar componentes deseados de su origen. Se determinan según su polaridad y su estructura molecular, polares, no polares, orgánicos y sintéticos y siempre está en mayor tamaño que el soluto (Lobos, 2019). Al elegir el solvente se debe tener en cuenta que no debe existir interacciones soluto y disolvente (Bosch Cartes & Olsen, 1990). El más usado es el agua y algunos son compuestos orgánicos, con enlaces de carbono-hidrógeno en su estructura (alcoholes, cetonas, hidrocarburos, entre otros). Los diferentes solventes disuelven las moléculas del disolvente se introducen en el sólido para separarlas (Mantilla & Elizabeth, 2014). Las semillas de Silybum marianum se extraen con disolventes de polaridad media escogida entre el acetato de etilo, etanol, acetona, metanol a 40-80 °C, lo cual se separa preferentemente por filtración. Se concentra preferiblemente al vacío (Nagell et al., 2007). Etanol. Es un disolvente polar ampliamente utilizado en la extracción de compuestos bioactivos a partir de material vegetal, debido a su eficacia para disolver 22 una amplia gama de metabolitos secundarios como flavonoides, alcaloides y fenoles. Además, es considerado un solvente seguro, biodegradable y aceptado en aplicaciones farmacéuticas y alimentarias (Stalikas, 2007). Agua. El agua tiene gran capacidad para diluir las componentes iónicas, polares, sustancias sólidas, líquidas y gaseosas (Peña Díaz et al., 2004). Sus características polares de la molécula tienen la capacidad de actuar como disolvente en sustancias polares y las que se disocian en iones como: la sal común, bicarbonato, etanol, cal y vinagre (Mora Anto & Agudelo Grajales, 2016). 2.2.3. Optimización de Proceso La optimización se relaciona con la mejora de un sistema, un desarrollo o un producto con el fin de obtener el máximo beneficio de este. El término optimización ha sido frecuentemente empleado para referirse a la búsqueda de las mejores condiciones de obtención, lo cual va a permitir la mejor respuesta posible (Lobos, 2019). 2.2.3.1. Metodología de Superficie de Respuesta (MSR). La metodología de superficie de respuesta (MSR) es un conjunto de técnicas estadísticas y matemáticas que se utilizan para modelar y analizar problemas en los que varias variables influyen en una respuesta o resultado de interés. Su objetivo principal es optimizar dicha respuesta encontrando las combinaciones óptimas de las variables independientes (factores). En términos más simples, la MSR ayuda a identificar la relación entre las variables que se controlan en un experimento (como la temperatura, la concentración de un reactivo, o el tiempo) y una variable de respuesta que queremos maximizar o minimizar (como la eficiencia) de un proceso o la calidad de un producto (Montgomery, 2004). 2.2.3.2. Diseño Box – Behnken. El diseño Box-Behnken es un tipo de diseño experimental que se utiliza dentro de la metodología de superficie de respuesta (MSR). Fue desarrollado por George Box y Donald Behnken en 1960 y es utilizado para optimizar procesos en los que varias variables o factores influyen en una respuesta (Box & Behnken, 1960). Este diseño se caracteriza por: Diseño Rotacional. El diseño es rotacional, lo que significa que los puntos experimentales están distribuidos uniformemente, ayudando a que las predicciones sean iguales de precisas en todas las direcciones (Box & Behnken, 1960). 23 Número Reducido de Experimentos. No incluye puntos en los vértices del espacio experimental, lo que hace que el número de experimentos sea menor que en los diseños factoriales completos o diseños compuestos centrales. Esto lo hace más económico y eficiente (Box & Behnken, 1960). Factores y Niveles. Se utiliza para estudios de tres o más factores (variables independientes), cada uno con tres niveles (bajo, medio, alto) (Box & Behnken, 1960). Puntos Experimentales. Los experimentos se realizan en puntos ubicados en el centro de las aristas de un cubo y en el centro del espacio experimental. Esto distribuye de manera eficiente los puntos de prueba para capturar el comportamiento del sistema (Box & Behnken, 1960). 2.3. Marco Conceptual a. Silybum marianum. Planta medicinal de la familia Asteraceae, conocida como cardo mariano. Sus semillas contienen flavonolignanos con propiedades hepatoprotectoras, antioxidantes y antiinflamatorias (Navarro & Montilla Herrera, 2012). Silimarina. Complejo de flavonolignanos presente en Silybum marianum, compuesto por silibina, silidianina y silicristina. Se utiliza en la industria farmacéutica por sus efectos protectores sobre el hígado (Navarro & Montilla Herrera, 2012). Metabolitos Secundarios. Compuestos bioactivos producidos por las plantas con funciones ecológicas y farmacológicas, como flavonoides, alcaloides y terpenoides (Rivas-Morales et al., 2016). b. Extracción Hidroalcohólica. Proceso de obtención de compuestos bioactivos mediante una mezcla de agua y etanol como disolventes, mejorando la solubilización de flavonolignanos y otros compuestos fenólicos (Jovanović et al., 2017). c. Maceración Dinámica. Técnica de extracción con agitación constante para mejorar la eficiencia y homogeneidad en la recuperación de compuestos activos (Duarte-Trujillo et al., 2020). d. Optimización de Procesos. Metodología utilizada para determinar condiciones óptimas de operación y maximizar la eficiencia de un procedimiento experimental (Montgomery, 2004). e. Diseño Box-Behnken. Diseño experimental utilizado en la Metodología de Superficie de Respuesta para evaluar el efecto de múltiples factores con un número reducido de experimentos (Box & Behnken, 1960). 24 f. Espectrofotometría UV-Vis. Técnica analítica que mide la absorción de luz en función de la longitud de onda, utilizada para cuantificar la concentración de silimarina en los extractos (Garcia, 2018). 2.4. Marco Ético y Legal El desarrollo de esta investigación se ajusta a normativas éticas y legales vigentes en el ámbito científico y ambiental. A continuación, se presentan las principales consideraciones: 2.4.1. Normas Éticas de Investigación Se cumple con las normativas del Comité de Ética en Investigación Científica (Vicerrectorado de Investigación, 2022), garantizando el rigor y la integridad en la experimentación. 2.4.2. Legislación Ambiental La recolección de semillas y el uso de solventes cumplen con las disposiciones establecidas en la Ley General del Ambiente (Ley N° 28611) del Perú (Congreso de la República, 2005), evitando impactos negativos en la biodiversidad. 2.4.5. Regulación en el uso de productos naturales Se respetan los lineamientos de la Convención sobre la Diversidad Biológica (Naciones Unidas, 1992) y el Protocolo de Nagoya (Naciones Unidas, 2011), asegurando el uso sostenible de los recursos naturales. 2.4.6. Normas de Bioseguridad Se siguen protocolos del Reglamento Interno de Seguridad y Salud en el Trabajo (Universidad Nacional de San Cristóbal de Huamanga, 2015) para el manejo de reactivos químicos y equipos de laboratorio, minimizando riesgos en el proceso de extracción y análisis. El cumplimiento de estas consideraciones éticas y legales garantiza que la investigación se desarrolle con responsabilidad científica y ambiental, contribuyendo al conocimiento sobre la extracción de silimarina con base en principios sustentables. 25 CAPÍTULO III. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Alcance de Investigación El presente estudio tiene un alcance explicativo (Hernández-Sampieri, 2018), ya que busca optimizar las condiciones de extracción hidroalcohólica de silimarina a partir de semillas de Silybum marianum, utilizando un diseño Box-Behnken dentro de la Metodología de Superficie de Respuesta (MSR). 3.2. Diseño de Investigación El diseño de investigación es experimental de tipo diseño factorial. La presente investigación se llevó a cabo considerando tres variables independientes: la temperatura de extracción (X1, °C), el tiempo de extracción (X2, min) y la concentración de etanol (X3, %), cada una evaluada en tres niveles mediante el diseño experimental de Box- Behnken. Los valores límite superior e inferior de las variables independientes se establecieron con base en investigaciones previas realizadas por Wianowska & Wis̈niewski (2015). El diseño experimental constó de 15 puntos, incluyendo tres réplicas en el punto central (Klongdee & Klinkesorn, 2022). Los valores codificados y reales de los factores considerados en los diseños experimentales se presentan en la Tabla 1. Tabla 1 Niveles de las variables independientes en el diseño experimental Variable Asignación Niveles -1 0 +1 X1 Temperatura (°C) 50 70 90 X2 Tiempo (min) 60 90 120 X3 Etanol (%) 30 60 90 Nota. Los valores representan los niveles codificados (-1, 0, +1) utilizados en el diseño experimental de Box-Behnken. 3.3. Unidad de Análisis La unidad de análisis en esta investigación está representada por los extractos hidroalcohólicos atomizados obtenidos a partir de las semillas de Silybum marianum. 26 Estos extractos son el objeto principal de estudio y se analizaron en función de su contenido de silimarina, empleando la técnica de espectrofotometría UV-Vis. 3.4. Población de Estudio La población de estudio en esta investigación está constituida por frutos secos de cardo mariano recolectados en la región de Ayacucho. 3.5. Muestra La muestra utilizada en la investigación consistió en frutos secos pulverizados de Silybum marianum, recolectados en el distrito de Quinua-Huamanga, Ayacucho. La técnica de muestreo fue no probabilístico, basado en conveniencia. 3.6. Criterios de Selección 3.6.1. Criterios de Inclusión a. Frutos maduros de Silybum marianum en óptimo estado de conservación. b. Procedencia del distrito de Quinua, región Ayacucho. 3.6.2. Criterios de Exclusión a. Frutos verdes o en proceso de maduración. b. Frutos con signos visibles de deterioro o contaminación. 3.7. Técnicas e Instrumentos de Recolección de Datos 3.7.1. Preparación de la Muestra Los frutos de cardo mariano se cosecharon en diciembre de 2024, en el distrito de Quinua (3300 msnm), provincia de Huamanga en el departamento de Ayacucho. Las semillas se separaron manualmente de las impurezas. La molienda de las semillas se realizó hasta un diámetro de partícula inferior a 0,5 mm utilizando un molinillo eléctrico. Las semillas molidas se almacenaron en desecador protegidos de la luz en bolsas con cierre hermético. 3.7.2. Obtención del Extracto Hidroalcohólico Se pesó 25 g de semilla pulverizada y se transfirió a un balón de rotavapor de 250 ml (previamente se acondicionó el equipo a los parámetros detallados en el anexo 3). Se adicionó una pequeña cantidad de solvente de extracción (etanol acuoso de 30, 60 y 90%), con la finalidad de humectar la droga vegetal y se dejó reposar unos 10 minutos y luego se agregó cantidad suficiente para completar a 100 ml de solvente de extracción. Se colocó el balón contenido de muestra en rotavapor sin vacío a temperatura de trabajo (50,70 y 90 °C), a tiempos (60, 90 y 120 minutos) y 40 rpm según el diseño Box–Behnken. Se retiró el balón y se filtró su contenido en un matraz de Buchner provisto de papel filtro. El extracto se recolectó en un vial de vidrio ámbar 27 de 60 ml con tapa de goma recubierta de teflón, luego se llevó a la refrigeradora para conservar. Finalmente, se concentró el solvente de extracción en un rotavapor a temperatura 65 °C y 40 rpm. El extracto obtenido fue secado por atomización a una temperatura de 120 °C, aspiración al 100% y de bomba 5%. El atomizador que se utilizó es un mini Spray Dryer B-290. Se pesó el extracto atomizado y se almacenó en el desecador en bolsas con cierre hermético de color ámbar. Los extractos a 90 °C se obtuvieron con el condensador encendido y matraz colector colocado del rotavapor ya que el etanol evapora a 78,3 °C. El solvente evaporado se devolvió al matraz de evaporación cada 15 minutos. Los extractos que se obtuvo con 90% de etanol, no se llevó al atomizador debido que el equipo no tolera muestras con etanol, por ello se llevó a la estufa a una temperatura de 40 °C por cinco días en placas Petri. Antes de llevar la muestra a la estufa, se pesó la placa Petri vacía y luego la placa con las muestras desecadas para obtener peso por diferencia. La eficiencia de la optimización del proceso de extracción me midió según el contenido de silimarina. 3.7.3. Análisis de Contenido de Silimarina a) Identificación en el Ultravioleta. Se dispuso cantidad suficiente de fiolas etiquetadas para el estándar. Para la identificación en el ultravioleta se pesó 5 mg de estándar de silimarina y cada una de las muestras atomizadas, se diluyó con 5 ml de metanol a 80 °C en baño maría con constante agitación y finalmente se completó a volumen de 10 ml con metanol. Se tomó una alícuota de 200 µl de la solución anterior a una fiola de 10 ml y se diluyó a volumen con metanol. Se examinó espectrofotométricamente la solución del estándar y de los extractos en celdas de cuarzo de 3 ml y se realizó el barrido espectral de 200 a 400 nm en un espectrofotómetro UV/VIS GENESYS™ 150. Se registró y comparó los espectros obtenidos concomitantemente para la solución estándar y de las soluciones del extracto (Aronés- Jara et al., 2025). b) Valoración de Silimarina. Se preparó una solución de cada uno de los 15 extractos de S. marianum atomizado a concentración de 0,01 mg/ml. Para ello, se pesó 5 mg de extracto atomizado que se transfirió a una fiola de 10 ml más 5 ml de metanol y se calentó a 80 °C en baño maría hasta disolver. Se dejó enfriar para luego enrasar a 10 ml con metanol. Se transfirió 200 µl de esta solución a un matraz volumétrico de 10 ml y se enrasó a volumen con metanol. Se examinó en el espectrofotómetro UV/VIS 28 marca GENESYS™ 150 en celdas de cuarzo de 3 ml a una longitud de onda de 288 nm, utilizando metanol como blanco. Para la valoración del estándar y del extracto obtenido en condiciones de extracción optimizadas se siguió el procedimiento descrito líneas arriba. La cantidad de silimarina se calculó empleando la siguiente fórmula: 𝑆𝑖𝑙𝑖𝑚𝑎𝑟𝑖𝑛𝑎(%) = 𝐴𝑚𝑝 × 10 × 5 × 10 41,2264 × 𝑃𝑚𝑝 × 100 Donde, 𝐴𝑚𝑝: absorbancia de la solución del extracto a 288 nm. Pmp: peso de muestra en mg. 41,2264 es la absortividad específica (Aronés-Jara et al., 2025). 3.8. Análisis de datos Los datos experimentales obtenidos del diseño Box-Behnken fueron sometidos a tratamientos estadísticos de acuerdo con lo expuesto por (Klongdee & Klinkesorn, 2022), con algunas modificaciones. Se realizó análisis de varianza (ANOVA) con el objetivo de determinar si existen diferencias entre las medias de los niveles de las variables (factores). La adecuación del modelo desarrollado se realizó evaluando el coeficiente de determinación (R2) y el efecto de los términos lineales, cuadráticos y de interacción de la variable de respuesta. Para optimizar las condiciones de extracción hidroalcohólico se empleó la metodología de superficie de respuesta (RSM), mediante gráficos de superficie de respuesta tridimensionales. Los datos se procesaron con el programa Minitab 21. 3.9. Consideraciones Éticas Esta investigación se rige bajo principios éticos que garantizan la integridad y validez de los resultados obtenidos. Se han considerado los siguientes aspectos: Respeto por el Medio Ambiente. La recolección de semillas de Silybum marianum se llevó a cabo sin alterar el ecosistema local, asegurando una extracción sostenible y sin impacto negativo en la biodiversidad. | Uso Responsable de Recursos. Se minimizó el uso de reactivos químicos y se emplearon métodos de extracción amigables con el ambiente. Transparencia y Rigor Científico. Todos los procedimientos experimentales y análisis de datos siguieron normativas internacionales de buenas prácticas de laboratorio. Citación y Reconocimiento de Fuentes. Se garantizó el adecuado reconocimiento de la literatura científica utilizada en la investigación. 29 CAPÍTULO IV. RESULTADOS 31 Tabla 2 Condiciones experimentales y contenido de silimarina en función de la temperatura (°C), tiempo (min) y concentración de etanol (%) Orden Corrida Temperatura (°C) Tiempo (min) Etanol (%) Silimarina (%) 1 90 120 60 37,55 2 70 60 30 27,82 3 70 90 60 56,03 4 50 90 90 70,02 5 70 120 90 38,48 6 90 60 60 39,00 7 70 60 90 44,95 8 90 90 30 23,31 9 70 90 60 56,67 10 50 90 30 32,42 11 90 90 90 50,94 12 70 90 60 56,52 13 70 120 30 23,78 14 50 120 60 54,58 15 50 60 60 59,67 32 Tabla 3 Análisis de varianza del modelo cuadrático para la optimización del contenido de silimarina Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p Modelo 7 2687,02 383,86 14,99 0,001 a) Lineal 3 1756,60 585,53 22,86 0,001 •Temperatura (°C) 1 542,69 542,69 21,19 0,002 •Tiempo (min) 1 36,34 36,34 1,42 0,272 •Etanol (%) 1 1177,58 1177,58 45,98 0,000 b) Cuadrado 3 927,10 309,03 12,07 0,004 •Temperatura (°C)*Temperatura (°C) 1 2,69 2,69 0,11 0,755 •Tiempo (min)*Tiempo (min) 1 337,51 337,51 13,18 0,008 •Etanol (%) *Etanol (%) 1 632,51 632,51 24,70 0,002 c) Interacción de 2 factores 1 3,31 3,31 0,13 0,730 •Temperatura (°C) *Tiempo (min) 1 3,31 3,31 0,13 0,730 Error 7 179,27 25,61 a) Falta de ajuste 5 179,05 35,81 319,63 0,003 b) Error puro 2 0,22 0,11 Total 14 2866,29 Nota. GL: grados de libertad. SC Ajust.: Suma de cuadrados ajustada. MC Ajust.: Media cuadrática ajustada. Valor F: Estadístico F. Valor p: Nivel de significancia estadística. 33 Tabla 4 Coeficientes codificados del modelo cuadrático para la predicción del contenido de silimarina Término Coef. EE del coef. Valor T Valor p FIV Constante 56,41 2,92 19,31 0,001 Temperatura (°C) -8,24 1,79 -4,60 0,002 1,00 Tiempo (min) -2,13 1,79 -1,19 0,272 1,00 Etanol (%) 12,13 1,79 6,78 0,000 1,00 Temperatura (°C) *Temperatura (°C) 0,85 2,63 0,32 0,755 1,01 Tiempo (min)*Tiempo (min) -9,56 2,63 -3,63 0,008 1,01 Etanol (%) *Etanol (%) -13,09 2,63 -4,97 0,002 1,01 Temperatura (°C) *Tiempo (min) 0,91 2,53 0,36 0,730 1,00 Nota. Coef. Coeficiente. EE del coef.: Error estándar del coeficiente. Valor T: Estadístico T. Valor p: nivel de significancia. FIV: Factor de inflación de la varianza. Nota. Ecuación del modelo: y = 56,41 − 8,24 ×1+ 2,13 ×2+ 12,13 ×3+ 9,56 ×1 2− 13,09 ×2 2− 13,09 ×3 2+ 0,91 ×1×2, donde Y: % de silimarina; X1: Temperatura (°C); X2: Tiempo (min); X3: Etanol (%). 34 Tabla 5 Indicadores de ajuste del modelo cuadrático para la predicción del contenido de silimarina S R-cuadrado R-cuadrado (ajustado) R-cuadrado (predicho) 5,06064 93,75% 87,49% 72,22% Nota. El modelo tiene varios efectos significativos, lo que indica que la respuesta (silimarina) varía de forma no lineal respecto a los factores. 35 Figura 3 Superficie de respuesta para la extracción de silimarina (%) en función de la temperatura (°C) y el tiempo (min) Nota. con Etanol (%) fijo en 60%. 36 Figura 4 Superficie de respuesta para la extracción de silimarina en función de la concentración de etanol (%) y el tiempo (min) Nota. Temperatura fija en 70 °C. 37 Figura 5 Superficie de respuesta para la extracción de silimarina en función de la concentración de etanol (%) y la temperatura (°C) Nota. Tiempo fijo en 90 minutos. 38 Figura 6 Diagrama de Pareto de efectos estandarizados para la extracción de silimarina Nota. A: Temperatura (°C). B: Tiempo (min). C: Etanol (%). Respuesta de Silimarina (%), α = 0,05). 0 1 2 3 4 5 6 7 C CC A BB B AC AB AA BC Efecto estandarizado Término 2,571 39 Tabla 6 Condiciones óptimas determinadas por el optimizador de respuesta para maximizar el contenido de silimarina Temperatura (°C) Tiempo (min) Etanol (%) Ajuste (%) IC 95% IP 95% Deseabilidad compuesta 50 85,455 73,636 68,549 (61,22; 75,88) (54,52; 82,58) 0,970591 Nota. Ajuste: Contenido estimado de silimarina. IC: intervalo de confianza. IP: Intervalo de predicción. 40 Tabla 7 Validación experimental del rendimiento de silimarina en condiciones optimizadas de temperatura (°C), tiempo (min) y concentración de etanol (%) Temperatura (°C) Tiempo (min) Etanol (%) Peso (mg) Promedio de absorbancias Silimarina (%) 50,0 84,85 76,67 5,10 ± 0,298 ± 0,0009 70,95 ± 0,21 Nota. Estándar de silimarina: 100,0% (Peso = 5,6 mg y absorbancia 0,462). 41 Figura 7 Barrido espectral UV-vis del extracto de semillas de Silybum marianum obtenido en condiciones óptimas de temperatura (°C), tiempo (min) y concentración de etanol (%) 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 200,0 240,0 280,0 320,0 360,0 400,0 A b so r b a n c ia Longitud de onda (nm) Estándar de Silimarina Extracto optimizado de Silybum marianum 43 CAPÍTULO V. DISCUSIÓN El presente estudio se centró en la optimización de la extracción hidroalcohólica de silimarina a partir de las semillas de Silybum marianum, considerando el efecto de la temperatura, el tiempo y la concentración de etanol en el rendimiento del proceso. La importancia de esta investigación radica en mejorar la eficiencia de extracción de flavonolignanos, compuestos con reconocidas propiedades hepatoprotectoras y antioxidante (Mam & Arafa, 2019; Navarro & Montilla Herrera, 2012). La optimización del proceso de extracción de silimarina de las semillas de Silybum marianum permitió evaluar el efecto de la temperatura, el tiempo de extracción y la concentración de etanol sobre el rendimiento del compuesto bioactivo. En la Tabla 2 se evidencia una amplia variabilidad en el contenido de silimarina, con valores entre 23,31% a 70,02% y la mayor concentración se obtuvo a 50 °C, 90 minutos y 90% de etanol, lo que va sugiriendo que temperaturas moderadas y disolvente con alta polaridad mejoran la solubilidad de la silimarina. Caso contrario, la menor recuperación se evidenció a temperaturas elevadas y baja concentración de etanol, esto debido probablemente a la degradación térmica y menor eficiencia de extracción. Del análisis de varianza se confirmó la significancia del método cuadrático (p = 0,001), destacando como factores significativos a la temperatura, la concentración de etanol y los términos cuadráticos de tiempo y etanol (Tabla 3). Previamente se evaluó al tiempo en su forma lineal, que no mostró un efecto estadísticamente significativo. Esto indica que, dentro del intervalo estudiado, la duración de la extracción tiene un efecto no lineal que debe considerarse cuidadosamente. Esta falta de capacidad predictiva podría deberse a factores no considerados en el modelo, como variaciones en la materia prima o efectos ambientales que podrían influir en la extracción. Por ello, el modelo optimizado del proceso de extracción de silimarina es útil para describir la relación entre variables en el conjunto de datos (Montgomery, 2004). Los coeficientes codificados (Tabla 4) permitieron establecer la ecuación predictiva del modelo, en la que se desataca un efecto positivo de la concentración de etanol y uno negativo para la temperatura. El efecto cuadrático negativo del etanol 44 confirma la existencia de un punto óptimo, más allá del cual el rendimiento disminuye. La ecuación generada presentó adecuados indicadores de ajuste (Tabla 5) con un R2 ajustado de 87,49% y un R2 predicho de 72,22%, lo que sugiere buena capacidad de explicación y predicción. Las gráficas de superficie de respuesta (Figuras 3, 4 y 5) confirmaron que las mayores concentraciones de silimarina se obtienen en combinaciones de baja temperatura y alta concentración de etanol. La variable más influyente según el diagrama de Pareto (Figura 6) fue el etanol, lo que concuerda con su efecto significativo en el modelo. El Diagrama de Pareto representa barras para cada factor, ordenadas de mayor a menor según el impacto que tienen en la respuesta, en este caso, el porcentaje de silimarina extraída. En el gráfico, la longitud de las barras refleja la magnitud del efecto de cada factor. Generalmente, los factores que superan la línea de significancia son considerados como aquellos con un efecto estadísticamente significativo sobre la variable de respuesta (Montgomery, 2004). Un análisis más detallado de la gráfica de superficie de respuesta de silimarina versus el tiempo (min) y la temperatura (°C), con la concentración de etanol (%) fijo en 60% (Figura 3), muestra una superficie cóncava, que sugiere que existe un punto máximo en la región de menos temperatura (~50-60 °C) y tiempo intermedio (~85-95 min). Se observa que la silimarina disminuye a medida que aumenta la temperatura hacia 90 °C. Igualmente, cuando el tiempo de extracción es demasiado corto o largo, el contenido de silimarina disminuye. Esto implica que la probablemente la silimarina es termosensible, por lo que temperaturas elevadas la degradan; así mismo, un tiempo de extracción demasiado largo también podría promover una degradación o saturación. Este hallazgo podría interpretarse desde una perspectiva química y de estabilidad del compuesto: temperaturas elevadas pueden afectar la integridad de los compuestos activos, el complejo de flavolignanos, degradándolos (Duan et al., 2009). Desde el punto de vista práctico, este resultado sugiere que es crucial mantener la temperatura dentro de un rango más bajo para maximizar la producción. Esto puede ser especialmente relevante en procesos industriales donde se controla la extracción por temperatura y en los cuales la degradación térmica puede ser un factor que limite la eficiencia de la extracción. Esto concuerda con estudios previos que han señalado que temperaturas elevadas pueden descomponer compuestos fenólicos sensibles, reduciendo su actividad biológica (ElGamal et al., 2023). 45 Al evaluar la gráfica de superficie de respuesta de silimarina versus la concentración de etanol (%) y tiempo (min), con temperatura fija en 70 °C (Figura 4), se evidencia un mayor rendimiento de silimarina con una concentración de etanol alrededor de 80-90% y un tiempo intermedio (~85-95 min), o sea, a medida que la concentración de etanol es menor a 60% y que el tiempo supera los 100 min, el rendimiento disminuye. Estos resultados dan a entender que el rendimiento aumenta rápidamente con el incremento de la concentración de etanol hasta un punto óptimo (~85-90%), confirmando lo visto en las otras gráficas. Así mismo, se entiende que el tiempo tiene un efecto cuadrático, que significa que ni muy poco no demasiado tiempo es ideal. Este comportamiento es común en procesos de extracción, ya que inicialmente el tiempo ayuda a extraer más sustancia, pero después de un tiempo prolongado, factores como la descomposición del compuesto pueden reducir la eficiencia (Nekkaa et al., 2021). Prácticamente, este hallazgo implica que prolongar el tiempo de extracción no siempre es beneficioso y podría resultar en un uso innecesario de recursos, además de posiblemente afectar negativamente el rendimiento. Estudios previos han demostrado que la extracción excesiva puede alterar la composición química del extracto debido a la oxidación, degradación de los metabolitos secundarios y extracción de sustancias no deseadas (Abderrezag et al., 2022; Drouet et al., 2019). La gráfica de superficie de respuesta de silimarina versus la concentración de etanol y temperatura con tiempo fjo en 90 min, permite observar que el máximo rendimiento se alcanza con una alta concentración de etanol (~90%) y con una temperatura intermedia-baja (~55-60 °C). En contraste, la reducción del rendimiento se obtiene cuando la temperatura superar los 75 °C y cuando la concentración de etanol disminuye (30-40%). Dado que la muestra hidroalcohólica es un solvente común para extraer compuestos bioactivos, este resultado concuerda con estudios previos donde esta mezcla optimiza la extracción de polifenoles y flavonoides (Nekkaa et al., 2021). Esto podría deberse a la reducción de la polaridad del solvente a concentraciones más altas de etanol, afectando la eficiencia de la extracción (Wallace et al., 2005). Estas diferencias pueden atribuirse a diversos factores, como la variabilidad en la materia prima utilizada, las diferencias en los métodos de extracción, las condiciones experimentales y la naturaleza química de los compuestos extraídos. Por ejemplo, (Abderrezag et al., 2022) reportaron una mayor concentración de silimarina con un 60% 46 de etanol, mientras que Drouet et al. (2019) indicaron un 54.5%, (Gilabadi et al., 2023) un 70%, (Hajiaghaee et al., 2018) un 80% y Ruan et al. (2018) un 43%. Estas discrepancias sugieren que la selección de la concentración de etanol debe considerar factores específicos del proceso de extracción para maximizar el rendimiento y la pureza del compuesto deseado. Para la práctica, es crucial ajustar el porcentaje de etanol en un rango óptimo, ya que aumentar el solvente no siempre maximizará la extracción y podría llevar a un uso ineficiente de materiales y reactivos. Respecto a las interacciones entre las variables (como temperatura-tiempo, temperatura-etanol y tiempo-etanol) no fueron estadísticamente significativas, lo que indica que cada variable afecta la extracción de silimarina de manera independiente en el rango de valores estudiado. Este hallazgo facilita el control del proceso, ya que las variables pueden ajustarse de forma individual para optimizar la extracción sin preocuparse por efectos combinados complejos (Montgomery, 2004). Los gráficos de diagnóstico (Figuras 7, Anexo 4 y 5) confirmaron que el modelo cumple los supuestos de normalidad, homocedasticidad e independencia de los residuos, respaldando la validez estadística del ajuste. Mediante el optimizador de respuesta (Tabla 6) se determinaron las condiciones óptimas para maximizar el contenido de silimarina: 50 °C, 85,45 minutos y 73,64% de etanol, prediciéndose un rendimiento de 68,55% de silimarina con una deseabilidad compuesta de 0,9706. Con la finalidad de validar experimentalmente las condiciones óptimas obtenidas mediante el modelo estadístico, se realizó una extracción bajo los parámetros predichos: 50 °C, 84,85 min y 76,67% de etanol (Tabla 7). El rendimiento relativo de silimarina en el extracto optimizado fue de 70,95 ± 0,21% que coincide estrechamente con la predicción del modelo (68,55%) y es superior a todos los rendimientos de silimarina reportados de los experimentados en la (Tabla 6 y 7). Este resultado confirma la validez y precisión del modelo de superficie de respuesta, lo cual respalda su uso para el diseño de procesos de extracción más eficientes. Además, demuestra la reproducibilidad del método y la factibilidad de aplicación en escalas mayores para fines farmacéuticos o industriales. Asimismo, la validación experimental (Figura 7) mediante barrido espectral demostró la similitud entre el extracto optimizado y el estándar de silimarina, confirmando la eficacia del modelo y la calidad del producto obtenido. 47 Gilabadi et al. (2023) lograron concentraciones de silimarina entre 36,23 y 40,93 mg/ml mediante maceración con etanol al 70% durante 7 días. Aunque su estudio se enfocó en la concentración en la fase líquida del extracto, el tiempo de extracción fue considerablemente mayor que el aplicado en esta investigación. Este contraste resalta la eficiencia del proceso optimizado en el presente estudio, donde se alcanzó un elevado rendimiento en menos de dos horas. Abderrezag et al. (2022) reportaron un rendimiento del 55,97% utilizando extracción líquida expandida con gas (GXL), y una concentración de silimarina de hasta 59,6%, lo cual indica que, si bien métodos como el GXL pueden ser altamente eficientes, requieren condiciones técnicas complejas y presión elevada (9 MPa), lo que limita su aplicabilidad en laboratorios convencionales. En comparación, el método optimizado propuesto en esta tesis utiliza condiciones más accesibles y alcanza un rendimiento superior en la concentración de silimarina Otros estudios, como el de Drouet et al. (2019), alcanzaron rendimientos de 20,28 ± 0,41 mg/g de peso seco mediante extracción asistida por ultrasonido. Aunque esta técnica es considerada verde y eficiente, el rendimiento obtenido es notablemente menor al reportado en esta investigación. Asimismo, Ruan et al. (2018) y Liu et al. (2009), quienes aplicaron extracción asistida por microondas y enzimas respectivamente, reportaron rendimientos de 6,83 mg/g y 24,81 mg/g de semillas desengrasadas, valores que, aunque significativos, no superan el porcentaje obtenido con la metodología actual. A nivel regional, Aronés et al. (2022) determinaron un contenido de silimarina del 75,2 ± 1,9 % en semillas de Silybum marianum, utilizando el método ASE con acetona. Si bien este porcentaje es ligeramente superior al del presente estudio, el uso de acetona puede representar una limitación en la aplicación farmacéutica directa. Por el contrario, el uso de etanol como disolvente en esta investigación resulta más adecuado por su aceptación en preparaciones galénicas. Adicionalmente, Hajiaghaee et al. (2018) y Wallace et al. (2005) demostraron que el tipo de disolvente, el desengrasado y el estado físico de la semilla influyen en el rendimiento. El presente estudio tomó en cuenta estos factores, al emplear semillas pulverizadas y etanol hidroalcohólico, lo que pudo haber favorecido la liberación de los flavonolignanos. En conjunto, los resultados del presente trabajo no solo se alinean con la literatura existente, sino que también aportan evidencia de que mediante la aplicación 48 de un diseño Box-Behnken y condiciones de maceración optimizadas, es posible obtener un extracto rico en silimarina con alto rendimiento y aplicabilidad farmacéutica, destacando el potencial del cardo mariano de la región Ayacucho como fuente viable de compuestos bioactivos. 49 CAPÍTULO VI. CONCLUSIONES 1. Se optimizó el proceso de extracción hidroalcohólica de silimarina a partir de las semillas de Silybum marianum mediante un diseño experimental de Box-Behnken, identificado condiciones óptimas que permitieron obtener un rendimiento ajustado de hasta 68,55%. 2. La concentración de etanol fue el factor más influyente en el rendimiento de silimarina, se observó que valores cercanos al 76,64% de etanol favorecieron una mayor solubilidad del compuesto. 3. Se determinó que una temperatura de 50 °C favorece el rendimiento de silimarina, evitando su degradación térmica. 4. El tiempo óptimo de extracción se encontró en 85,84 minutos, asimismo, tiempos mayores no incrementaron significativamente el rendimiento. 5. Las condiciones óptimas determinadas fueron 50 °C de temperatura, 85,45 minutos de extracción y 73,64% de etanol, las cuales permitieron alcanzar un contenido de silimarina de 68,55%, con una deseabilidad compuesta de 0,9706. 51 CAPÍTULO VII. RECOMENDACIONES a. Se recomienda realizar estudios complementarios sobre la estabilidad de la silimarina extraída en diferentes condiciones de almacenamiento para garantizar su calidad y eficacia en formulaciones farmacéuticas. b. Es necesario evaluar la bioactividad de los extractos obtenidos mediante estudios in vitro e in vivo para confirmar sus efectos hepatoprotectores y antioxidantes. c. Se sugiere explorar el uso de técnicas de extracción asistida, como ultrasonido o microondas, para mejorar la eficiencia del proceso y reducir el tiempo de extracción. d. Para aplicaciones industriales, se recomienda realizar escalamiento del proceso optimizado y evaluar su viabilidad económica en la producción a gran escala. e. Se sugiere investigar el impacto ambiental del uso de solventes en el proceso de extracción y desarrollar estrategias para minimizar los residuos generados, promoviendo un enfoque más sustentable. f. Se recomienda optimizar las condiciones del proceso de secado en el atomizador con el fin de maximizar el rendimiento de la silimarina. g. Finalmente, se recomienda la realización de ensayos clínicos que permitan evaluar la seguridad y eficacia del extracto optimizado. 53 BIBLIOGRAFÍA Abdallah, M. 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