UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTOBAL DE HUAMANGA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS ESCUELA DE FORMACI6N PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUIMICA Efecto diuretico del extracto hidroalcoholico de las hojas de Polylepis racemosa R. & P. "qenoa", Ayacucho 2012. TESIS PARA OPTENER EL TITULO PROFESIONAL DE QUIMICO FARMAC^UTICO P R E S E N T A D O POR: Bach. QUINTANA PAREDES, CESAR JULIAN AYACUCHO - PERU 2013 UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTOBAL DE HUAMANGA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGIC AS E S C U E L A D E FORMACION P R O F E S I O N A L D E FARMACIA Y BIOQUIMICA Acta de Sustentacion de Tesis R.D. N 178-2013-FCB-D Bach. Cesar Julian QUINTANA PAREDES En la ciudad de Ayacucho a los veinticinco dias del mes de octubre del afio dos mil trece, siendo las cuatro y diez de la tarde, se reunieron en el auditorio de la Facultada de Ciencias Biologicas, los miembros del Jurado Calificador bajo la presidencia del Mg. Jose Manuel Diez Macavilca (Memorandum N° 713-2013- UNSCH-FCB); Mg. Enrique Javier Aguilar Felices, Mg. Blgo. Javier J . Naccha Urbano (Jurado - secretario encargado), los cuales recepcionaron la sustentacion de la tesis titulado: "Efecto diuretico del extracto hidroalcoholico de las hojas de Polylepis racemosa R. & P. "qenoa", Ayacucho 2012. Presentado por el Bachiller en Farmacia y Bioquimica Cesar Julian QUINTANA PAREDES, quien pretende obtener el titulo profesional de Quimico Farmaceutico. Como primer acto el presidente del Jurado Calificador invito al senor secretario (e) dar la lectura a la Resolution Decanal que declare expedida la sustentacion de tesis y dio instrucciones al sustentante para su exposition. Culminada la sustentacion el senor presidente (e) del Jurado Calificador solicito la participacion de los miembros del Jurado Calificador para realizar observaciones, aclaraciones y/o preguntas que crean por conveniente para realizar la calificacion correspondiente. Los miembros participaron en el siguiente orden Mg. Blgo. Javier J . Naccha Urbano; Mg. Enrique Javier Aguilar Felices y el presidente (e) Mg. Jose Manuel Diez Macavilca. Culminada la fase de participacion invito ai senor sustentante y al publico asistente abandonar el auditorio de la Facultad de Ciencias Biologicas para que el Jurado Calificador delibere y realizar la calificacion. Obteniendose la siguiente calificacion: Jurado Califlcador Exposicion Respuesta a Preguntas Promedio Mg. JAVIER J . NACCHA URBANO 17.0 17.0 17.0 Mg. Enrique Javier AGUILAR F E L I C E S 16.0 16.0 16.0 Mg. Jose Manuel DIEZ MACAVILCA 17.0 17.0 17.0 Promedio Total = 17.0 De la evaluacion realizada el sustentante obtuvo la nota promedio de DIESCISIETE (17); de la cual dan fe los miembros del Jurado Califlcador, estampando su firma al pie en la presente acta, culminando a las seis de la tarde. Mg. Jay/efjJ. NACCHA URBANO Miembro - Secretario (e) DEDICATORIA A mi madre Isabel, a ella con gratitud y reconocimiento por siempre. ii AGRADECIMIENTO Especial agradecimiento a la Universidad Nacional de San Cristobal de Huamanga y a los docentes que en ella laboran, por su invalorable apoyo academico y moral quienes son forjadores de nuevos profesionales al servicio de la sociedad. A la Facultad de Ciencias Biologicas, en especial a la Escuela de Formacion Profesional de Farmacia y Bioquimica, por facilitarme los medios necesarios para la realizacion de este trabajo de investigacion, y a sus docentes por sus ensenanzas y orientaciones durante mi formacion profesional. A mis asesores Dr. Q.F. TINCO JAYO, Johnny Aldo, Mg. AGUILAR FEL ICES, Enrique Javier. Por su apoyo permanente en el desarrollo del presente trabajo de investigacion. A todas las personas que de una u otra manera me han colaborado en la realizacion del presente trabajo. iii INDICE GENERAL Pagina DEDICATORIA ii AGRADECIMIENTO iii INDICE GENERAL iv INDICE DE TABLAS v INDICE DE FIGURAS vi INDICE DE ANEXOS vii RESUMEN viii I. INTRODUCCION 1 II. MARCO TE6RICO 4 2.1 Antecedentes 4 2.2. Polylepis racemosa R. & P. "qenoa" 5 2.2.1. Clasificacion taxonomica 5 2.2.2. Description botanica 5 2.3. Composition quimica 7 2.4. Fisiologia renal 11 2.4.1. Funciones del rinon 11 2.4.2. Fisiologia de la formacion de la orina 13 2.5. Farmacologi'a renal 14 2.5.1. Diureticos 15 2.5.2. Clasificacion de los diureticos 15 2.5.3. Furosemida 16 III. MATERIALES Y METODOS 19 3.1. Ubicacion 19 3.2. Materiales 19 3.3. Diseno metodologico 19 3.4. Diseno experimental 22 3.5. Analisis estadistico 22 IV. RESULTADOS 23 V. DISCUSIONES 30 VI. CONCLUSIONES 37 VII. RECOMENDACIONES 38 VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 39 ANEXOS 41 iv INDICE DE TABLAS Pagina Tabla 1. Metabolitos secundarios presentes en el extracto hidroalcoholico 24 v INDICE DE FIGURAS Pagina Figura 1. (I) Fenol, (II) salicilato de metilo 8 Figura 2. (I) acido galico 8 Figura 3. Digoxina y digitoxina 10 Figura 4. (I) Flavona 11 Figura 5. (I) Furosemida 16 Figura 6. Variacion de volumen de orina en funcion del tiempo por efecto de los tratamientos 25 Figura 7. Porcentaje de la actividad diuretica por efecto de los tratamientos 26 Figura 8. Niveles de Sodio (mEq/l) por efecto de los tratamientos 27 Figura 9. Niveles de Potasio (mEq/l) por efecto de los tratamientos 28 Figura 10. Niveles del ion Cloruro (mEq/l) por efecto de los 29 tratamientos vi INDICE DE ANEXOS Pagina Anexo 1. Certificado de clasificacion taxonomica 42 Anexo 2. Resultados del dosaje de electrolitos segun tratamientos. 43 Anexo 3. Volumen de orina de cobayos a determinados tiempos, por efecto de los tratamientos 44 Anexo 4. Promedio de los valores de electrolitos en orina de cobayos por efecto de los tratamientos 45 Anexo 5. Analisis de varianza del porcentaje de la actividad diuretica 46 Anexo 6. Prueba de Tukey del porcentaje de la actividad diuretica por efecto de los tratamientos 47 Anexo 7. Analisis de varianza de los niveles de sodio por efecto de los tratamientos 48 Anexo 8. Prueba de Tukey de los niveles de sodio por efecto de los tratamientos 49 Anexo 9. Analisis de varianza de los niveles de potasio por efecto de los tratamientos 50 Anexo 10. Prueba de Tukey de los niveles de potasio por efecto de los tratamientos 51 Anexo 11. Analisis de varianza de los niveles de ion cloruro por efecto de los tratamientos 52 Anexo 12. Prueba de Tukey de los niveles de ion cloruro por efecto de los tratamientos 53 Anexo 13. Flujograma del efecto diuretica del extracto hidroalcohoiico de las hojas de Polylepis racemosa R. & P. "qenoa" 54 Anexo 14. Flujograma del efecto diuretica del extracto hidroalcohoiico de las hojas de Polylepis racemosa R. & P. "qenoa" 55 Anexo 15. Matriz de consistencia 56 vii RESUMED Las plantas medicinales utilizadas en la medicina tradicional como diureticos son muy utiles para el tratamiento de la hipertension arterial, para prevenir eventos cardiovasculares y en casos de edemas. El presente trabajo se realizo con el proposito de determinar el efecto diuretico del extracto hidroalcoholico de las hojas de Polylepis racemosa R. &. P. "qenoa". El tipo de investigation fue experimental, desarrollado en los laboratories de Farmacologia y Farmacognosia de la Facultad de Ciencias Biologicas de la Universidad National de San Cristobal de Huamanga, durante los meses de noviembre del 2012 a febrero del 2013. La muestra fue recolectada en el distrito de Quinua, provincia de Huamanga, departamento de Ayacucho a 3300 msnm. Se prepare un extracto hidroalcoholico utilizando etanol al 80%, al extracto obtenido se ie realizo el tamizaje fitoquimico para identificar los metabolitos secundarios. El efecto diuretico se determino utilizando el metodo de Naik et a/., 1 en cobayos divididos en cinco grupos de cinco cada uno, el grupo I fue el control, el II recibio furosemida como farmaco de referenda y el III, IV y V grupo recibieron 100, 200 y 400 mg/kg del extracto respectivamente. Se calculo el porcentaje de la actividad diuretica y los electrolitos Na +, K + y el CI" por el metodo de ion selectivo (ISE); las diferencias entre los tratamientos se evaluaron mediante el analisis de varianza y la Prueba de Tukey. Los metabolitos secundarios presentes fueron taninos, saponinas, cardenolidos y flavonoides. Los porcentajes de actividad diuretica fueron 41,10%; 59,02 y 67,42% a las dosis de 100, 200 y 400 mg/kg respectivamente (p<0,05); y respecto a los electrolitos no existio diferencias (p>0,05). Se concluye que el extracto tuvo una moderada actividad diuretica. Palabras clave. Polylepis racemosa R. &. P., extracto hidroalcoholico, actividad diuretica. viii I. INTRODUCCION E s evidente que en nuestro pa is los problemas de salud se han venido resolviendo con el empleo alternativo de plantas medicinales, practica que se ha transmitido de generacion en generacion, continuan siendo un valioso arsenal de sustancias, ya sea en forma de medicamento vegetal o de materia prima para la industria farmaceutica. Muchas de estas plantas utilizadas popularmente con fines medicinales, no cuentan con estudios farmacologicos que validen las actividades terapeuticas atribuidas a las mismas, por lo que es importante realizar dichos estudios para poder contribuir con la poblacion que las utiliza, dando a conocer su potencial terapeutico para que puedan ser utilizadas de forma adecuada y segura. En la UNSCH, se han realizado muchos estudios de plantas con efecto diuretica, sin embargo no existe al presente ningun estudio de Polylepis racemosa R. &. P. "qenoa" en relacion al efecto diuretico por lo que se propuso realizar la presente investigation. Ciertos metabolitos secundarios ejercen la actividad diuretica, con la mayor eliminacion del volumen de orina, en el cual se acompana la eliminacion de electrolitos (Na\ K + y CP). Segun Murrillo y Dawson,2 indican que un 80% de la poblacion de America Latina usa plantas medicinales y metodos para cut arse transmitidos de generacion a generacion. Ademas, las grandes companias farmaceuticas usan estas plantas para producir muchos medicamentos. 1 Los diureticos constituyen un grupo indispensable de medicamentos que se usan para ajustar el volumen, la composition o ambos de los liquidos corporales en diversas situaciones clinicas. Son agentes que producen un incremento de la excrecion urinaria de agua y de sodio, que actua directamente a nivel renal. A pesar de los nuevos farmacos disponibles en la actualidad, el uso de los diureticos todavia representa una excelente alternativa de tratamiento antihipertensivo para prevenir eventos cardiovasculares en diversos grupos de pacientes y constituyen una de las clases mas valiosas de medicamentos a elegir como terapia initial de la hipertension arterial esencial.3 Los diureticos son farmacos que estimulan la excrecion renal de agua y electrolitos. Su objetivo fundamental es conseguir un balance negativo de agua, pero los diureticos no actuan directamente sobre el agua, sino a traves del sodio (diureticos natriureticos) o de la osmolaridad (diureticos osmoticos). De acuerdo con ello, la finaiidad principal de los diureticos se dirige al tratamiento de los edemas.4 Objetivo general: • Evaluar el efecto diuretico del extracto hidroalcoholico de las hojas de Polylepis racemosa R. & P. "qenoa". Objetivos especmcos: • Identificar los metabolitos secundarios presentes en el extracto hidroalcoholico de las hojas de Polylepis racemosa R. & P. "qenoa" mediante tamizaje fitoquimico. • Determinar la concentration optima diuretica del extracto hidroalcoholico de las hojas de Polylepis racemosa R. & P. "qenoa". • Comparar el efecto diuretico del extracto hidroalcoholico de las hojas de Polylepis racemosa R. & P. "qenoa" con el estandar Furosemida. 2 • Realizar el dosaje de electrolitos de Na \ K + y Cl", en la orina de cobayos Cavia Porcellus, por efecto del extracto hidroalcohoiico de las hojas de Polylepis racemosa R. & P. "qenoa". 3 II. MARCO TEORICO 2.1. Antecedentes No se encuentra en la literatura cientifica reportes sobre el efecto diuretico de esta planta; sin embargo, existen estudios quimicos y farmacologicos de dicha especie y de sus congeneres llevados a cabo en varios paises. Daud et al.,5 Ilevaron a cabo el trabajo de investigacion. "Actividad diuretica de extractos acuosos de Polylepis australis Bitter (quenoa)". El objetivo de dicho trabajo fue realizar un estudio experimental en ratas Wistar con el fin de analizar la actividad diuretica de extractos acuosos de hojas y corteza de quenoa, Polylepis australis Bitter, administrados por via oral. Se demostro el efecto diuretico de los extractos en las dosis de 200 y 400 mg/kg presentando mayor accion, actividad diuretica y saluretica frente al grupo control y a la furosemida (20 mg/kg). Se analizo la relacion Na7K + y se observo un incremento frente al control negativo e inferior frente al diuretico de referenda, lo que sugeriria que los extractos acuosos de hojas y corteza de quenoa podrian actuar como diureticos tiazidicos, los cuales aumentan los niveles urinarios de K + alterando la relacion Na +/K +. Los resultados validarian el uso popular de hojas y corteza de quenoa como antihipertensivo como consecuencia de su actividad diuretica. Lorenzo et al.,6 estudiaron la composition del aceite esencial de Polylepis 4 besseri Hieron. ssp. besseri de Bolivia. En aquel trabajo se analizo el aceite esencial de las partes aereas por GC y GC/MS; se identificaron 43 componentes (90% de la composition total). El estudio mostro que los componentes principales son los diterpenos abietadieno (40,3%) y abietatrieno (6,1%). Neto et al.,7 investigaron la citotoxicidad por fraccionamiento guiado de! extracto de la corteza y del tallo de Polylepis racemosa R. & P. Este condujo a la identificacion del acido ursolico, acido pomolico, 3-O-acido acetilpomolico, y acido 2-oxopomolico. El acido pomolico fue el componente mas citotoxico, y era especifico para melanoma M-14 y carcinoma cervical ME180, con valores Gl 5 0 de 6,9 y 8,3 mg/ml respectivamente. 2.2. Polylepis racemosa R. & P. "qenoa" 2.2.1. Clasificacion taxonomica Division Magnoliophyta Clase Magnoliopsida Subclase Rosidae Orden Rosales Famiiia Rosaceae Genera Polylepis Especie Polylepis racemosa R. & P. Nombre vulgar: "qefioa", "quinual" Fuente: Herbariun Huamangensis- 2012 (Anexo 1) 2.2.2. Descripcion botanica Aspecto general Arbol de porte pequefio a mediano. Mide hasta ocho m a doce m de altura y 20 a 40 cm de diametro. Su fuste es irregular y nudoso. 5 Corteza La corteza externa es lisa, de color marron rojizo, y se descascara en laminas, con la consistencia de trozos de papel, de color rojizo. La corteza interna es muy delgada y de color crema claro. Hojas Las hojas son compuestas, con tres a cinco laminas, alternas, dispuestas en espiral. Las laminas son elipticas a oblongas, de dos y medio cm a tres y medio cm de longitud por un cm de ancho, con el apice redondo a agudo, el borde con dientes suaves y la base aguda, los peciolos miden dos cm a tres cm de longitud. Los nervios secundarios son de 10 a 12 pares. Flores Las flores se hallan en racimos pendulos de varias flores pequenas, de color verduzco, de dos mm a tres mm de longitud. Portan ambos sexos. No poseen caliz ni corola, solamente tepalos. Los estambres son numerosos y muy pequenos, y el pistilo es unico y diminuto. Frutos Los frutos son pequenos, secos e irregulares, de unos cinco mm de longitud. 2.2.3. Observaciones para el reconocimiento de la especie Esta especie se reconoce con facilidad por su corteza externa lisa, de color marron rojizo, que se descascara en laminas, con la consistencia de trozos de papel, de color rojizo. Tambien por sus hojas normalmente con tres laminas, estan finamente lanosas por ei reverso y grandes comparativamente a otras especies del mismo genero. 2.2.4. Distribucion y habitat Se distribuye en toda la zona andina del Peru. Tambien en Ecuador y Bolivia. El rango aititudinal de la especie esta entre 1 800 a 5 000 m.s.n.m.8 Crece en la puna, algunas especies son subniveles porque viven cerca de las 6 nieves perpetuas de los Andes (arriba de los 4,000 m.s.n.m.). Conforman las comunidades denominadas "quinuales".9 2.2.5. Fenologia Se registra floracion entre mayo y noviembre; fructification, entre abril y julio. 2.2.6. Estado de conservation Ha sido propagada ampliamente en la sierra del Peru durante el periodo 1980 a 1990; de este modo se ha promovido su perduracion. Se trata de una especie aparentemente fuera de peligro en la actualidad.8 2.2.7. Propiedades y usos medicinales Sus ramas y hojas que contienen una fuerte proporcion de tanino, se emplean como tanantes en la curtiembre de los cueros.1 0 Las hojas y ramitas, trituradas y hervidas, proporcionan un tinte de color marron claro que se emplea en el tenido de prendas de lana y algodon en lugares de la sierra peruana. En la medicina traditional se usa la corteza interna en infusion para las afecciones respiratorias.8 En el Caliejon de Huaylas, una decoction de la corteza de Polylepis racemosa R. & P., mezclada con las hojas de Alnus jouillensis se bebe para tratar la inflamacion del utero y el cancer de utero.11 2.3. Composition quimica Fenoles Los compuestos fenolicos estan ampliamente distribuidos en la naturaieza en el reino vegetal, todos ellos presentan un anillo bencenico que puede estar unido a grupos hidroxilos libres o combinados en forma de ester, eter, heterosidos, etc. 1 2 El fenol es un desinfectante general que se encuentra en el alquitran de hulla; el salicilato de metilo es un agente saborizante del aceite de gaulteria.13 7 OH OH C r f ^ O CH 3 (I) (II) Figura 1. (I) Fenol, (II) Salicilato de metilo .13 Las dos acciones mas importantes de los acidos fenolicos son la actividad antimicrobiana, preferentemente frente a bacterias G (+), utilizandose como antiseptico, desinfectante, antiinflamatoria, analgesica y antipiretica.12 En la industria, se emplea en la fabrication de plasticos y de diversos colorantes, tambien se emplea como anestesico local en aerosoles para la garganta irritada y como antiseptico en la cirugia.14 El termino tanino fue introducido por Seguin en 1796 para designar a ciertas sustancias presentes en extractos vegetales capaces de combinarse con las proteinas de la piel, evitando su putrefaction y convirtiendola en cuero. Estas sustancias tienen ademas otras propiedades comunes, como las de dar reacciones con cloruro ferrico, reducir el permanganato de potasio y precipitar con gelatina. Las dos primeras senalan ya su caracter fenolico. Se distinguen dos tipos de tanino. 1. Taninos hidrolizables son hidrosolubles por acidos, alcalis y enzimas. Se ha clistinguido dos tipos de taninos hidrolizables: tanino galico y elagicos. Taninos COOH OH (I) Figura 2. (I) Acido galico .12 8 2. Taninos condensados o proantocianidinas, son oligomeros y polimeros flavanicos, estan constituidos por catequinas.12 Las aplicaciones de las drogas con taninos son limitadas y derivan de sus propiedades astringentes. Al precipitar las proteinas, los taninos originan un efecto antimicrobiano y antifungico. Ademas los taninos son hemostaticos y, como precipitan los alcaloides, pueden servir de antidoto en caso de intoxication.15 Los curtientes vegetaies tipicos son los taninos con dos tipos principales: los derivados del acido galico y los derivados de la catequina. Los curtientes vegetaies son hidrosolubles y pardos, dan al cuero su olor tipico, al oxidarse se obscurecen, floculan y sedimentan. Con sales de hierro forman intensos colores negros: tintes de hierro; por este motivo las tenerias deben cuidar mucho la elimination de estos iones.1 6 Saponinas Las saponinas derivan del latin sapo: jabon, son compuestos que al agitarse en agua producen abundante espuma. Debido a esta propiedad, a las plantas que las contienen se usa como jabon, como es el caso de los rizomas de varias especies de amarilidaceas, que se usaban como jabon desde epocas prehispanicas y aun actualmente. Estructuralmente las saponinas o glucosidos son compuestos organicos que contienen uno o varios azucares. Se clasifican como esteroidales o triterpeninas, dependiendo de la naturaleza de la aglicona. Las saponinas por hidrolisis acida o enzimatica dan origen a una sustancia libre del o los azucares formando asi la sapogenina. Actualmente se ha visto que las saponinas son compuestos importantes en la defensa de la planta. Algunos son reguladores del crecimiento. Las saponinas triterpenicas presentan actividad biologica, cardiaca y hemolitica, se usan como veneno de peces, reducen el colesterol, otras tienen actividades 9 espermaticidas, antiinflamatorias, etc. Las saponinas esteroidales tienen propiedades biologicas similares a las triterpenicas pero son menos abundantes en la naturaleza.17 Cardenolidos Los cardenolidos se encuentran como glicosidos en las hojas de las variedades de Digitalis (digitalis purpura = digital rojo). Los glic6sidos digitalicos mas importantes son: digitoxina, digoxina y gitoxina.18 Los heterosidos cardiotonicos estan formados por una parte glucidica y una parte no glucidica (agiicon o genina) que contiene un nucleo esteroidico unido a un anillo lactonico insaturado. Los heterosidos cardiotonicos ejercen una accion sobre el corazon aumentando la fuerza de contraction del miocardio (inotropismo positivo), disminuyen la frecuencia cardiaca (cronotropismo negativo) y disminuye la velocidad de conduction a traves del nodo auriculo-ventricular (dromotropismo negativo). Tambien mejoran la circulation general y aumentan la filtration renal produciendo un efecto diuretico como consecuencia de su efecto sobre el corazon. Tienen un margen terapeutico muy estrecho debido a su elevada toxicidad.19 (digitoxosa - 0)] Digitoxina (R=H) Digoxina (R=OH) Figura 3. Digoxina y Digitoxina 19 10 Flavonoides Los flavonoides son compuestos polifenolicos ampliamente distribuidos en la naturaieza. Se encuentra principalmente localizado en los organos jovenes (tallos, raices) de las plantas superiores. El papel que se le atribuye a los flavonoides en las plantas abarca funciones muy diversas. Asi por ejemplo, podrian tener papel importante en los mecanismos de obtencion de energia o formar parte de las defensas anti-infecciosas de las plantas en las que se encuentran. Algunos flavonoides presentan importantes propiedades farmacologicas (actividad antihipertensiva, antibiotica, diuretica, expectorante, antineoplasica etc.). 2 0 O (I) Figura 4. (I) Flavona12 Ademas del interes farmacologico, son importantes las aplicaciones industriales derivadas de su capacidad de absorcion de las radiaciones visibles y ultravioletas, entre las que cabe destacar su uso como fotoprotectores en cremas solares, estabilizantes frer/te al envejecimiento por la luz y el calor en plasticos, en preparaciones para fotografia en color, como bloqueadores opticos, etc. 2 0 2.4. Fisiologia Renal 2.4.1. Funciones que desempena el rinon Los rinones realizan el trabajo mas importante en el sistema urinario, puesto que las otras partes son practicamente vias de paso y areas de almacenamiento. Al 11 filtrar la sangre y formar la orina, los rinones contribuyen a la homeostasis de varias maneras. Las funciones renales incluyen: a. Regulation de la composition ionica de la sangre Los rinones ayudan a regular la concentration de distintos iones en la sangre, principalmente los iones sodio, potasio, calcio, cloruro y fosfato.21 b. Regulation de la presion arterial Los rinones desempenan una funcion dominante en la regulation a largo plazo de la presion arterial al excretar cantidades variables de sodio y agua. Tambien contribuyen a la regulation a corto plazo de la presion arterial mediante la secrecion de factores o sustancias vasoactivas, como la renina, que dan lugar a la formacion de productos vasoactivas (por ejemplo la angiotensina II) . 2 2 c. Regulation de los equilibrios hidricos y electrolitico El concepto de equilibrio o balance establece que el cuerpo humano se encuentra equilibrado o balanceado con respecto a una sustancia especifica cuando las cantidades de la misma que entran son iguales a las que salen. 2 3 d. Excretion de productos metabolicos de desecho y sustancias quimicas extranas, farmacos y metabolites de hormonas Los rinones son los principales medios de elimination de ios productos de desecho del metabolismo que ya no necesita el cuerpo. Estos productos son la urea (del metabolismo de los aminoacidos), la creatinina (de la creatinina muscular), el acido urico (de los acidos nucleicos), los productos finales del metabolismo de la hemoglobina (como la bilirrubina) y los metabolitos de varias hormonas, estos productos de desecho deben eliminarse del cuerpo tan rapidamente como se producen. Los rinones tambien eliminan la mayoria de las toxinas y otras sustancias extranas que el cuerpo produce o ingiere, como los pesticidas, los farmacos y los aditivos alimentarios.22 12 e. Regulation del equilibrio del acido-basico Los rinones contribuyen a la regulation acidobasica junto a los pulmones y los amortiguadores en el liquido corporal. Los rinones son los unicos medios de eliminar ciertos tipos de acidos, como el acido sulfurico y el acido fosforico que genera el metabolismo de las proteinas. f. Regulation del pH sanguineo Los rinones excretan una cantidad variable de H + en la orina y retienen iones bicarbonate (HC03~), un importante amortiguador de H + . Estas son dos actividades que contribuyen a regular el pH sanguineo. g. Liberation de hormonas Los rinones liberan dos hormonas: calcitriol, la forma activa de la vitamina D, que ayuda a regular la homeostasis de calcio, y la eritropoyetina, que estimula la production de eritrocitos.21 2.4.2. Fisiologia de la formation de la orina La formacion de la orina comienza con la filtracion glomerular (FG), Normalmente se filtra alrededor de 180 litros diarios de liquido: el glomerulo filtra todos los componentes solubles de la sangre menos proteinas plasmaticas. Mas del 90% de la filtracion glomerular es reabsorbido en los tubulos; se produce aproximadamente 1,5 litros de orina en 24 horas. La accion fundamental de los diureticos es inhibir la reabsorcion tubular.24 La formacion de orina en las nefronas implica tres procesos fisiologicos, son la filtracion glomerular, la reabsorcion tubular y la secretion tubular. La filtracion glomerular es el liquido que se filtra fuera de la sangre al circular a traves de los glomerulos de las nefronas. Su composition es similar a la del plasma sanguineo, excepto que normalmente no contiene proteinas plasmaticas o elementos formes de la sangre a causa de su gran tamano y alto peso molecular. 13 a. La filtracion glomeruEar Es un proceso pasivo y es mantenido por la presion sanguinea del mismo glomerulo. Bajo presion, el agua, la glucosa, los aminoacidcs y los electrolitos son filtrados fuera de los capitales glomerulares a ia capsula de Bowman. b. La reabsorcion tubular Es un medio importante de conservation de agua, la glucosa, los aminoacidos y los electrolitos corporal. Estas moleculas son reabsorbidas por transporte activo, difusion y osmosis. De los 125 ml de FG formados en un minuto por los rinones, 124 ml son reabsorbidos a traves de los tubulos a los capilares peritubulares, los cuales son parte del sistema circulatorio. Por esta razon, menos del 1 % del FG es excretado como orina. c. La secrecion tubular Es lo contrario a la reabsorcion tubular. Algunas moleculas son extraidas selectivamente de los capilares peritubulares y se anaden al filtrado en los tubulos del rinon mediante los procesos de transporte activo y difusion. La secrecion tubular es un mecanismo importante para eliminar sustancias toxicas o sobrantes de la sangre y para controlar el pH sanguineo.25 2.5. Farmacologia renal Los rinones participan en la homeostasis dei medio interno; su funcion principal es mantener el pH, el volumen y la concentracion de los liquidos corporales. Esta action homeostatica se realiza a traves de tres funciones: secretora, reguladora y excretora. La unidad anatomofuncional del rinon es el neron. Cada rinon contiene 1 a 1,2 millones de nefrones. Cada rinon produce aproximadamente 1,2 a 1,5 litros de orina cada 24 horas.2 6 Los diureticos aumentan la production de orina y por ello son utiies para todas aquellas enfermedades en las que hay un exceso de agua en los tejidos, tambien se utilizan para e! tratamiento de la hipertension.27 14 2.5.1 Diureticos Los diureticos son farmacos que actuan sobre los rinones aumentando el volumen urinario al reducir la reabsorcion de sal y agua desde los tubulos.28 La finalidad principal de los diureticos se dirige al tratamiento de los edemas, sin embargo, directa o indirectamente pueden modificar otros iones y alterar otras funciones, de ahi que se utilicen tambien en otras enfermedades, como la hipertension arterial, las hipercalcemias, la diabetes insipida, el glaucoma, las intoxicaciones.29 Un diuretico es una sustancia que aumenta el volumen de orina, tambien aumentan la excretion urinaria de solutos en especial de sodio y de cloro. El uso clinico mas comun de los diureticos es reducir el volumen de liquido extracelular, en especial en enfermedades asociadas a edema e hipertension.22 2.5.2. Clasificacion de los diureticos La clasificacion que predomina actualmente es la que combina, en Iq posible, la eficacia diuretica, con el sitio de action y con la estructura quimica. a. Diureticos de maxima eficacia Actuan en los segmentos diluyentes; la fraccion de eliminacion de Na + es superior al 15 %. Los mas importantes son los sulfamoilbenzoatos furosemida, bumetanida y piretanida, el derivado de la sulfonilurea torasemida (torsemida), el derivado del acido fenoxiacetico acido etacrinico y la tiazolidona etozolina. b. Diureticos de eficacia medians Actuan en la porcion final del segmento diluyente cortical y en el primer segmento del tubulo distal; la fraccion de eliminacion de Na + es del 5-10 %. Pertenecen a este grupo las benzotiadiazinas (tiazidas e hidrotiazidas): hidroclorotiazida, altizida, bendroflumetiazida y mebutizida; sus derivados son clopamida, clortalidona, indapamida, xipamida y quinetazona. c. Diureticos de eficacia ligera La fraccion de eliminacion de Na* es inferior al 5 %. Su sitio de action es 15 variable: • Ahorradores de K +: actuan en el ultimo segmento del tubulo distal por inhibition de la aldosterona: espironolactona y canrenoato de potasio, o con independencia de la aldosterona: amilorida y triamtereno. • Inhibidores de la anhidrasa carbonica: acetazolamida y diciorfenamida. • Agentes osmoticos: actuan en el tubulo proximal: manitol e isosorbida.29 Los diureticos de ASA son los diureticos mas potentes que existen. Actuan bloqueando la reabsorcion de cloro y sodio a lo largo de la rama ascendente del asa de Henle y a nivel del tubulo contorneado proximal. Tambien producen vasodilatacion principalmente a nivel renal y pulmonar.30 2.5.3. Furosemida a. Quimica. Furosemida o acido 4 - cloro - N - furfuril - 5 - sulfamoilantranilico,31 es un derivado, del acido antranilico; el acido etaci inico del acido arilacetico y la bumetanida del acido 3-aminobenzoico.32 COOH HoN ( I ) Figura 5. (I) Furosemida' 33 b. Mecanismo de action Los diureticos de alta eficacia, o llamados tambien diureticos del asa, actuan inhibiendo la reabsorcion tubular del Na y Cl, en el segmento medular y cortical de la rama ascendente gruesa del asa de Henle. La action se relaciona con una inhibition de la enzima Na-K ATPasa. 16 La furosemida y bumetanida, tambien inhiben a la anhidrasa carbonica, pero esta accion es muy debil para ser importante. Tambien aumentan el flujo sanguineo renal, y el riego sanguineo de la medula renal, pudiendo asi interferir con el mecanismo multiplicador de contracorriente, que necesita que la medula renal, sea hipertonica. De cualquier manera, estos diureticos, aumentan definidamente la excretion de sodio, potasio, cloruro, y agua. 3 2 c. Acciones farmacologicas y efectos adversos El efecto diuretico es usualmente muy intenso. El flujo urinario puede ser torrential (de hasta 10 litros en 24 horas.). Esta poderosa droga puede ocasionar un desequilibrio hidroelectrolitico, que puede ser grave, por lo que debe vigilarse a los pacientes bien de cerca. Como los tiazidicos los diureticos de alta eficacia, tambien incrementan la excretion de potasio, pudiendo ocasionar hipopotasemia. Tambien pueden producir hiperuricemia por el mecanismo descripto para las tiazidas. Aumentan la excretion de magnesio, y al contrario de las tiazidas aumentan la elimination del calcio (accion calciurica), que puede ser util en pacientes con hipercalcemia sintomatica, pueden provocar ototoxicidad por cambios electroliticos en la endolinfa del oido medio. El efecto adverso puede provocar hipoacusia y sordera, que es posible sea reversible. Por este efecto es peligrosa la administracion conjunta, con aminoglucosidos cuya accion tambien ototoxica puede potenciarse. De la misma manera, la nefrotoxicidad de las cefalosporinas de las ultimas generaciones, o de los mismos aminoglucosidos puede incrementarse significativamente, con la administracion conjunta con furosemida o acido etacrinico. Tambien pueden aparecer reaccionen, como hemorragias digestivas, hipoplasias medulares, alergia cutanea, y disfuncion hepatica. 17 d. Farmacocinetica Los diureticos de alta eficacia se absorben rapidamente por via oral poseen buena biodisponibilidad, y se unen ampliamente a las proteinas plasmaticas. Se secretan activamente en al tubulo proximal, y por el fluido tubular llegan a su sitio de action en el asa de Henle. Se metabolizan parcialmente en el higado, conjugandose con acido glucuronico. e. Usos terapeuticos • Sindromes edematosos: de origen cardiaco, renal o hepatico. Deben usarse con precaution, son preferibles los tiazidicos por su action menos intensa. • Insuficiencia cardiaca aguda, edema agudo de pulmon: en este caso la rapida reduction del volumen de liquido extracelular puede producir una rapida mejorla. • Insuficiencia renal aguda: en casos de oligoanuria o anuria de reciente comienzo. • Crisis o emergencias hipertensivas: Por la rapida disminucion de la volemia, que pueden provocar.32 18 III. MATERIALES Y METODOS 3.1. Ubicacion El presente trabajo de investigation se realizo en los Laboratories de Farmacologia y Farmacognosia, del Area de Farmacia de la Facultad de Ciencias Biologicas de la Universidad Nacional de San Cristobal de Huamanga durante los meses de octubre del 2012 a febrero del 2013. 3.2. Materiales 3.2.1. Poblacion Planta de Polylepis racemosa R. & P. "qenoa" que se recolectaron del distrito de Quinua, a una altura de 3300 m.s.n.m., provincia de Huamanga, region de Ayacucho. 3.2.2. Muestra Se utilizo tres kg de hojas de Polylepis racemosa R. & P. "qenoa". Racolectados en buen estado, una parte fue enviado para su identificacion al Herbarium Huamangensis de la Facultad de Ciencias Biologicas de la Universidad Nacional de San Cristobal de Huamanga. 3.2.3. Animates de experimentation 25 cobayos Caw'a Porcellus de la misma edad, sexo (machos) entre 500 +/- 50 g de peso, adquiridos del Instituto Nacional de Investigation Agraria. 3.3. Diseno metodologico: Basico-experimental. 19 3.3.1. Procedimiento meiodologico para la recoleccion de datos 3.3.1.1. Recoleccion de la muestra La recoleccion, selection y secado de las muestras se realizaron de acuerdo a los procedimientos establecidos por Villar del Fresno, 1 2 se selecciono las hojas intactas, se lavaron con abundante agua y se distribuyo en una habitation ventilada, sobre papel periodico para su secado, aproximadamente por una semana a temperatura ambiente, siendo trasladado a los laboratorios del Area de Farmacia, para su posterior reduction de tamano de particulas haciendo uso de un mortero de porcelana hasta obtener un polvo fino. 3.3.1.2. Obtencion del extracto hidroalcohoiico Aproximadamente 500 g de muestra seca y molida se maceraron en un frasco de color ambar durante una semana en alcohol a 80°, cubriendo la muestra unos 10 cm. Durante el proceso se agito el frasco periodicamente para que el alcohol se distribuya homogeneamente en la muestra. Transcurrido el tiempo de maceration, se procedio a su filtrado al vacio, enseguida, se concentro en una estufa a 40°C, sobre placas Petri. Hasta obtener un extracto seco, envasado en un frasco de vidrio color ambar de 120 ml, almacenados bajo refrigeration a 4°C, hasta el momento de su empleo. 3.3.1.3. Tamizaje fitoquimico Las reacciones de identification de los diferentes metabolitos secundarios del extracto hidroalcohoiico se realizo siguiendo los procedimientos propuestos por Miranda y Cuellar.34 3.3.1.4. Farmaco de referencia Dos tableta de Lasix (furosemida 40mg), fabricado por Sanofi Aventis, N° de lote 253315. 3.3.1.5. Preparation de las concentraciones Se realizo una solution madre utilizando como vehiculo agua destilada, 20 seguidamente se prepararon concentraciones de 100 mg/kg, 200 mg/kg y 400 mg/kg. 3.3.1.6. Determination del efecto diuretico Fundamento: La metodologia que se empleo para la determination de la actividad diuretica se basa en el metodo utilizado por Naik et al.? Consiste en hidratar con solucion salina fisiologica al 0.9% a una dosis de 50 ml/kg por via oral, luego deshidratar con la administracion de la furosemida y extracto hidroalcoholico a los animales en estudio. Procedimiento: • Se utilizo 25 cobayos Caw'a Porcellus, con un peso de 500 +/- 50 g de peso los cuales se dejo en ayunas 10 a 12 horas antes de realizar el experimento, sin privarlas de agua. • Los cobayos fueron marcadas, pesados y distribuidos aleatoriamente en cinco grupos de cinco animales cada grupo. • Todos los animales fueron hidratados con solucion salina fisiologica ai 0.9% a una dosis de 50 ml/kg por via oral mediante sonda nasogastrica y se les coloca en la jaula de diuresis. • Despues de 20 minutos de la hidratacion fueron pesados y se les administro farmaco y extracto hidroalcoholico, a las dosis a evaluar. Luego se les coloca en la jaula de diuresis, recoiectando a partir de ese momento la orina cada 30 minutos por un periodo de cuatro horas. Para determinar el efecto, se procede a pesar a los animales inmediatamente despues de haber concluido el experimento, y por diferencia de peso se calculara aproximadamente el volumen eliminado; asimismo, se medira en una probeta el volumen de orina eliminado, para poder comparar el efecto producido. 21 El dosaje de electrolitos se realizo en el Hospital Nacional Arzobispo Loayza por el metodo de ion selectivo (ISE), (Anexo 2). 3.4. Diseno experimental Se formo cinco grupos de cinco cobayos cada uno distribuido aleatoriamente, los que fueron sometidos a los siguientes tratamientos: • Grupo I: Tratado con solution de cloruro de sodio al 0.9%, a una dosis de 50 ml/kg, bianco. • Grupo II: Tratado con Furosemida a dosis de 20 mg/kg de peso, control. • Grupo III: Administrando con el extracto hidroalcoholico a dosis de 100 mg/kg de peso. • Grupo IV: Administrando con el extracto hidroalcoholico a dosis de 200 mg/kg de peso. • Grupo V: Administrando con el extracto hidroalcoholico a dosis de 400 mg/kg de peso. Los valores de la actividad diuretica se obtuvieron en porcentaje (%), se determino utilizando ia siguiente formula: Volumen de orina excretada % AD = — —— — X 100 Vol. orina del diuretico stand ar 3.5. Analisis de datos. Los datos obtenidos del volumen de orina fueron expresadas como ± media, desviacion estandar de cada tratamiento, se calculo el porcentaje de la actividad diuretica, donde se representaron en forma de figuras, barras de tendencia de error. Asimismo fueron sometidos al analisis de varianza (ANOVA) que permitio determinar la existencia de diferencias estadisticamente significativas. Las diterencias intergrupos se analizaron por la prueba de Tukey, para el estudio se utilizo un nivel de significancia p < 0,05, el software estadistico S P S S version 20,0 y Microsoft Office Excel 2010. 22 IV. RESULTADOS 23 Tabla 1. Metabolitos secundarios presentes en el extracto hidroalcoholico. Metabolitos secundarios Ensayo Resultados Observaci6n Fenoles y/o Taninos Cloruro ferrico +++ Verde azulado Azucares reductores Benedict + Rojo naranja Flavonoides Shinoda ++ Amarillo a rojo Saponinas. Espuma +++ Presenta espuma CardenGlidos. Kedde +++ Formaci6n de un anillo violeta Leyenda: (-) : Abundante (+) Poco cantidad (++) Mediana cantidad (+++) Mayor cantidad 24 Blanco Furosemida lOOmgAg 200mg/kg 400mg/kg Tiempo (horas) Figura 6. Variacion de volumen de orina en funcion del tiempo por efecto de los tratamientos. 25 120- i 1 1 r Furosemida 100 mg/kg 200 mg/kg 400 mg/kg Tratamientos Figura 7. Porcentaje de !a actividad diuretica por efecto de los tratamientos. 26 100- „ T 1 1 1 r Blanco Furosemida 100 mg/kg 200 mg/kg 400 mg/kg Tratamientos Figura 8. Niveles de Sodio (mEq/I) por efecto de los tratamientos. 27 10- i 1 1 r Blanco Furosemida 100 mg/kg 200 mg/kg 400 mg/kg Tratamientos Figura 9. Niveles de Potasio (mEq/l) por efecto de los tratamientos. 28 120- Blanco Furosemida 100 mg/kg 200 mg/kg 400 mg/kg Tratamientos Figura 10. Niveles del ion Cloruro (mEq/l) por efecto de los tratamientos. 29 V. DISCUSION Para determinar el efecto diuretico de las hojas de Polylepis racemosa R. & P. "qenoa", se utilizo el metodo propuesto por Naik ef a/., 1 siendo este un metodo adecuado y economico para la realization de este tipo de trabajo de investigation, los animaies de experimentation fueron 25 cobayos Cavia Porcellus machos de 500+/-50g, provenientes de la INIA (Instituto Nacional de Investigation Agraria). Para el presente estudio de investigation se tomo como muestra las hojas de Polylepis racemosa R. & P. (qenoa), teniendo en cuenta los resultados obtenidos por Daud et al.,5 donde la mejor actividad presento las hojas que la corteza en su investigation "actividad diuretica de extractos acuosos de Polylepis australis Bitter (quenoa)": a la dosis de 200 y 400 mg/kg de peso tiene una actividad de 1,1 y 1,9% respectivamente (hojas) mientras la corteza tiene una actividad de 1,24 y 1,52 % respectivamente, tambien se opto por las hojas de Polylepis racemosa R. & P. por su facil recoleccion y manipuleo de la muestra. Afirman que los extractos hidroalcoholico?; son los que extraen la mayor diversidad de componentes quimicos presentes en drogas, en donde la concentration de principios activos es optima, facilitandose la dosificacion de los mismos. Es asi que la planta en estudio se llego a extraer con alcohol al 80 0 . 3 4 30 En tamizaje fitoquimico, los metabolitos secundarios preserves en el extracto se determinaron utilizando pruebas espetificas de coloration y precipitation; donde se encontro la mayor presencia de fenoles y/o taninos, saponinas, y cardenolidos, en mediana cantidad los flavonoides (Tabla 1). En el Anexo 3, se muestran los volumenes de orina colectados para cada grupo de tratamiento, permite apreciar que la diuresis se incrementan a medida que pasa el tiempo y a la dosis administrada. superando as! ia furosemida con el mayor volumen de orina excretada, en los diferentes intervalos de tiempos evaluados, respecto a los extractos hidroalcoholicos de las hojas de Polylepis racemosa R. & P. "qenoa", pues la furosemida actua a nivel del segmento grueso de la rama ascendente del asa de Henle bloqueando a la proteina couansportadora de Na +-K +-2CI" e impidiendo el transporte de estos iones a traves de la membrana, como consecuencia se produce una elimination de, Na + K + y Cl", al mismo tiempo de C a + + , Mg + + y bicarbonato,35 alcanzando asi con la furosemida a las cuatro horas un volumen promedio de orina de 15,96 ml siendo el mejor diuretico frente a los diferentes tratamientos, por su rapida absorcion y buena biodisponibilidad, mientras que con el extracto de 100 mg/kg se obtuvo 6,56 ml de orina, inferior a la del blancc (cloruro de sodio) que fue de 6,68 ml, a la dosis de 200 mg/kg un volumen de 9,42 ml, sin mostrar diferencia de forma acentuada con el bianco y finalmente con la dosis de 400 mg/kg, se obtiene 10,76 ml de orina, que se aproxima al volumen obtenido por la furosemida respecto a los demas dosis. Asi mismo, en la Figura 6, se evidencia la variation del volumen de orina en funcion del tiempo, en donde la diuresis con la furosemida comienza a aumentar significativamente el volumen de orina eliminado a partir de las dos horas y media, corroborando su caracter diuretico de alta eficiencia, con 400 mg/kg de peso se obitrvo un constante incremento de diuresis, mientras con 100 y 200 mg/kg la diuresis es similar con el bianco. 31 Discutiendo con otros autores que realizaron trabajos de actividad diuretica en la Universidad Nacional de San Cristobal de Huamanga por Perez, 3 6 y Luna, 3 7 quienes reportaron en la diuresis con la furosemida valores de 16 y 19,2 ml de orina respectivamente, y son semejantes con el presente trabajo alcanzando una diuresis de 15,96 ml los cuales confirman que la furosemida es un diuretico eficaz. Por ello, los diureticos son agentes empleados para tratar la hipertension, insuficiencia cardiaca, insuficiencia renal, smdrome nefrotico y cirrosis,29 principalmente se usan en el tratamiento de los edemas, 2 3 su efecto antihipertensivo ejerce a traves del aumento de la excrecion renal de sodio y agua, esto se traduce en una disminucion del volumen plasmatico y de la carga cardiaca, los mas utilizados son las tiazidas. En la insuficiencia cardiaca se produce retention de sodio y agua debido a la combination de la reduction de flujo sanguineo a nivel renal, aumento de la secrecion de la hormona antidiuretica y renina que conlleva un aumento de secrecion de angiotensina y aidosterona. Los diureticos disminuyen la retention de sodio y agua, aunque iambien se ha postulado que pueden tener efectos vasodilatadores, la furosemida es el mas utilizado en la insuficiencia cardiaca mas severa. 3 8 En la Figura 7, se muestra ei porcentaje de la actividad diuretica por efecto de los tratamientos, siendo !a furosemida como estandar represento el 100% de la actividad diuretica, mientras que los extractos de 100; 200 y 400 mg/kg con una actividad a 41,10%; 59,02% y 67,42% respectivamente, las dos primeras representarian solamente la mitad de la actividau diuretica de la furosemida y son cuantitativamente similares, la de 400 mg/kg presento una moderada actividad diuretica frente al estandar, y es dosis dependiente, debido a que la excretion de orina y actividad diuretica de los grupos tratados a la dosis de 100 mg/kg fue mas baja que cuando se trataron con la dosis de 400 mg/kg como se muestra mas arriba. 32 El analisis de varianza es un metodo que sirve para comparar mas de dos medias, mediante este analisis la actividad diuretica por efecto de los tratamientos (Anexo 5), se observo que hay una diferencia significativa entre los tratamientos, para especificar esta diferencia se concurre a la prueba de Tukey (Anexo 6), el cual mostro cuatro subgrupos, a 100 mg/kg y bianco tuvo menor actividad diuretica, bianco y 200 mg/kg son estadisticamente homogeneos, con 400 mg/kg presento una moderada actividad y una actividad optima con la furosemida. Al comparar los resultados del efecto diuretico del extracto hidroalcoholico de las hojas de Polylepis racemosa "qenoa", con otras investigaciones que han evaluado el mismo efecto diuretico, del mismo genero y especie diferente de la planta a diferentes niveles de dosis, reportan valores diferentes, por ejemplo con los extractos acuosos de Polylepis australis Bitter (qenoa)", ia action diuretica de 200 y 400 mg/kg de peso fueron 1,58 y 2,77%, respectivamente, los resultados de 200 mg/kg son similares a los de la furosemida (1,42%), diuretico de referenda, superando al mismo con 400 mg/kg,5 con los resultados obtenidos se puede deducir que hay una diferencia entre las especies Polylepis racemosa "qenoa" y Polylepis australis Bitter "qenoa", y el medio geografico de habitat, pues las hojas de Polylepis australis Bitter fueron recolectados en los valles de Tucuman, Argentina, los animales de experimento fueron ratas Wistar. Segun Pretell et a/ . , 3 9 senala la principal distribution natural, por regiones, de las siguientes especies, Polylepis incana: Ancash, Lima, Huanuco, Pasco, Junln, Ayacucho, Cusco y Puno. Polylepis racemosa: La Libertad, Ancash, Lima, Huanuco, Pasco, Junin, Huancavelica y Cusco. Esto no coincide con la identificacibn realizada por el Herbarium Huamangensis de la Facultad de Ciencias Biologicas de la Universidad National de San Cristobal de Huamanga. 33 En la Figura 8 y Anexo 4, se observo mejor eliminacion de sodio con la furosemida (64,26 mEq/l) respecto a los extractos, pues la furosemida en un buen natriuretico, mientras que los extractos no muestran diferencia con el bianco, corroborado por la prueba de Tukey, a la dosis de 400 mg/kg (44,76 mEq/l), tuvo una moderada eliminacion de sodio, en comparacion a las otras concentraciones como 100 mg/kg (31,8 mEq/l) y 200 mg/kg (33,32 mEq/l), apreciandose de estos dos ultimos la semejanza con el bianco (32,66 mEq/l). El analisis de varianza (Anexo 7) demostro, que existe diferencia significativa entre los tratamientos, y en la prueba de Tukey (Anexos 8), con Blanco, 100, 200 y 400 mg/kg se comprueba que son estadisticamente homogeneos. Mientras con la furosemida hay una buena eliminacion de sodio. En el tubulo contorneado proximal se absorbe aproximadamente el 67% del agua filtrada, del Na +, K +, Ci" y otros solutos, ademas de practicamente toda la glucosa y los aminoacidos. La presencia de la bomba de Na +-K +-ATPasa en la membrana basolateral del tubulo proximal es fundamental para la reabsorcion. En el asa de Henle, se absorbe el 25% del NaCI filtrado y los iones K +, CI" y HC0 3". La mayor parte de esta reabsorcion se lleva a cabo en el segmento grueso ascendente, en el segmento delgado descendente se reabsorbe el 15% del agua filtrada, hecho que solamente tiene lugar en esta parte del asa de Henle puesto que el segmento ascendente es impermeable al agua. En tubulo contorneado distal reabsorbe aproximadamente el 7% de NaCI filtrado y una cantidad variable de agua (8%-17%). 4 0 En la Figura 9 y Anexo 4, se observo la eliminacion de potasio, con la furosemida (5,88 mEq/l), 400 mg/kg (7,05 mEq/l), 200 mg/kg (7,46 mEq/l) 100 mg/kg (7,82 mEq/l), en analisis de varianza (Anexo 9) mostro que no hay diferencia significativa entre los tratamientos y la prueba de Tukey (Anexo 10) reporta que todos ios tratamientos son estadisticamente homogeneos. Los diureticos de asa 34 al aumentar la excrecion de Na \ por difusion pasiva, aumenta la excrecion de K +, y por un proceso activo de contracorriente aumenta la excrecion de H + (acidez titulable) y amonio (NH 4 +). Por lo tanto la perdida excesiva de potasio, hidrogeniones y cloruros puede conducir a una alcalosis metabolica hipocloremica con hipopotasemia.26 En la Figura 10, se muestra la eliminacion del ion cloruro, donde la furosemida suma el Na + y k+ eliminado, por lo tanto la eliminacion de CI" fue mayor. El analisis de varianza demuestra la diferencia entre los tratamientos (Anexo 11), y la prueba de Tukey (Anexo 12), se mostro que los extractos son estadisticamente homogeneos y la furosemida tuvo mejor eliminacion del ion cloruro (82,7 mEq/l) respecto a los extractos, considerado de esta manera un farmaco con optima actividad y eliminacion de sodio y cloro, a la dosis de 400 mg/kg peso tuvo una actividad y eliminacion de sodio moderada. Comparando con los estudics realizados por Daud et al.,5 sobre la actividad diuretica de extractos acuosos de Polylepis australis Bitter "qenoa", donde la furosemida produjo una eliminacion de sodio (59,5 ± 5,2 mEq/l), potasio (55,83± 4,75 mEq/l) y cloro (87,29 ± 6,9 mEq/l); a dosis 200 mg/kg, eliminacidn de sodio (24,00 ± 1,5 mEq/l), potasio (38,00 ± 2,00 mEq/l) y cloro (54,00 ± 1,5 mEq/l); a dosis 400 mg/kg eliminacion de sodio (35,5 ± 2,3 mEq/l), potasio (36,8 ±1 ,8 mEq/l) y cloro (86,00 ± 5,8 mEq/l), y por Perez, 4 1 cuando valido un Metodo in vivo para evaluar la actividad diuretica, la furosemida produjo una eliminacion de sodio (98,27 ±11,3 mEq/l), potasio (39,43 ± 10,6 mEq/l), Estas diferencias se deben a varios factores como la fisiologia del animal, lugar de experimentacion y la extraction de metabolitos. El efecto diuretico se le atribuye a la presencia de varios principios activos, aunque no esta claro el grado de contribution de cada uno de ellos, en cuanto a su mecanismo de action, los saponosidos y flavonoides podrian actuar a nivel 35 glomerular mas que a nivel tubular, provocando un aumento de la circulacion renal e incrementando asi de la tasa de filtration glomerular y formacion de 42 orina. Finalmente a condiciones experimentales el extracto hidroalcohoiico de las hojas de Polylepis racemosa R. & P. "qenoa" ha evidenciado tener moderado efecto diuretico a la dosis de 400 mg/kg de peso. Asimismo, el extracto fue menos natriuretico que la furosemida y produjo ligeramente superior que la furosemida respecto al potasio. 36 VI. CONCLUSIONES 1. El efecto diuretico del extracto hidroalcoholico de las hojas de Polylepis racemosa R. & P. "qenoa". presents una actividad diuretica de 67,42% a dosis de 400 mg/kg de peso, en comparacion con los demas concentraciones usadas, lo cual indica una moderada actividad diuretica. 2. Se encontro la presencia de metabolitos secundarios como: taninos, fenoles, flavonoides, saponinas, y cardenolidos. 3. los niveles de Sodio (44,76 mEq/l) y Cloro (67,36 mEq/l) a dosis de 400 mg/kg de peso, eliminados en orina fueron significativarnente menores a la furosemida, Sodio (64,24 mEq/l), y Cloro (82,7 mEq/l). 37 VII. RECOMENDACIONES 1. Contar con los materiales y equipos adecuados para determinar la concentracion de electrolitos y luego elucidar y aislar los principios activos responsables de la actividad farmacologica. 2. Complementar el estudio toxicologico de la actividad diuretica del extracto hidroalcohoiico de Polylepis racemosa R. & P. ' qenoa". 3. Contar con mas profesionales de amplio conocimiento en e! reconocimiento adecuado de las plantas de nuestra region. 38 VIII. 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EL J E F E DEL HERBARIUM HUAMANGENSIS DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLCGICAS DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTOBAL DE HUAMANGA C E R T I F I C A Que, el Bach, en Farmacia y Bioquimica, Sr. Cesar Jul ian, QUINTANA s i P A R E D E S , ha solicitado la identificacion de una muestra vegetal para trabajo de tesis. Diqha muestra ha sido estudiada y determinada segun el Sistema de Clasificacion de Cronquist. A. 1988. y es como sigue: DIVISION MAGNOLIOPHYTA C L A S E MAGNOLIOPSIDA SUB C L A S E ROSIDAE ORDEN R O S A L E S FAMiLIA ROSACEAE G E N E R O Polylepis E S P E C I E Polylepis racemosa R.& P. N.V. "qenoa", "quinual" Se expide la certificacion correspondiente a solicitud del interesado para los fines que estime conveniente. Ayacucho, 22 deAgostodel 2012 42 ANEXO 2. Tabla 3. Resultados del dosaje de electrolitos segun tratamientos. HOSPITAL NACIONAL ARZOBISPO LOAYZA DPTO. Patologi'a cli'nica y banco de sangre LABORATORIO CENTRAL Fecha Reg: 05/02/2013 Fecha Rep: 07/02/2013 H.C.: 1111111 Nombre: Quintana Paredes Cesar J. Origen: C. Externa Servicio: MEDICINA GENERAL Reporte del dosaje de electrolitos (Na+, K+, y CI") del efecto diuretico del extracto hidroalcoholico de las hojas de polylepis racemosa "qefioa", Ayacucho 2012. Tratamiento Na K CI Blanco - 1 35,4 7,25 52,3 Blanco - 2 23,8 7,72 54,3 Blanco - 3 35,4 7,42 52,4 Blanco - 4 38,1 7,72 48,8 Blanco - 5 30,6 6,14 45,3 Furosemida - 1 91,9 6,27 95,3 Furosemida - 2 62,2 7,89 89,0 Furosemida - 3 55,3 5,19 75,5 Furosemida - 4 62,2 5.02 89,0 Furosemida - 5 49,7 5.01 64,7 100 mg/kg-1 24,6 9,44 48,7 100 mg/kg-2 40,7 7,91 59,7 100 mg/kg -3 36,0 9,44 52,0 100 mg/kg-4 25,9 4,26 50,0 100 mg/kg -5 37,8 8,03 64,4 200 mg/kg-1 30,0 9,34 62,5 200 mg/kg-2 32,5 5,11 69,9 200 mg/kg-3 33,2 8,82 62,5 200 mg/kg-4 33,6 4,49 61,0 200 mg/kg-S 37,3 9,56 58,6 400 mg/kg-1 39,2 8,58 62,1 400 mg/kg-2 39,7 7,89 62,7 400 mg/kg-3 48,6 6,71 69,4 400 mg/kg - 4 46,6 5,94 77,9 400 mg/kg-S 49,7 6,14 64,7 Equipo de electrolitos por la metodologia de Ion selectivo (ISE) que determina Na/K/CI suero, plasma, orina tambien para uso veterinario. Rangode detecdon: Na 20 - 200 mEq/L K 0.2 - 40 mEq/L „ „ - . . . .„ CI 25 - 200 mEq/L TSrbWAirJwgRgwsw UfcOTW* (T*K* < ^»»" 43 Anexo 3 Tabla 4. Volumen de orina de cobayos a determinados tiempos por efecto de los tratamientos. Volumen promedio de orina (ml). Tiempo (min.) Furosemida Blanco 20 mg/kg 0 2,30 6,74 30 3,52 7,48 60 4,12 8,04 90 4,78 9,16 120 5,34 10,52 150 5,84 13,05 180 6,16 14,6 210 6,68 15,96 Extracto hidroalcohoiico de polylepis racemosa R. & P. "qenoa". 100 mg/kg 200 mg/kg 400 mg/kg 2,08 3,06 4,30 3,14 3,42 4,88 3,42 3,86 5,66 3,86 5,24 6,70 4,62 5,60 7,42 5,46 6,32 8,48 6,32 8,02 9,92 6,56 9,42 10,76 44 Anexo 4 Tabla 5. Promedio de los valores de electrolitos en orina de cobayos por efecto de los tratamientos. Tratamientos Na+ (mEq/l) K + (mEq/l) c r (mEq/l) Blanco 32,66 7,25 50,62 Furosemida 64,26 5,88 82,7 100mg/kg 31,8 7,82 54,96 200mg/kg 33,32 7,46 62,9 400mg/kg 44,76 7,05 67,36 45 Anexo 5 Tabla 6. Analisis de varianza del porcentaje de la actividad diuretica. Actividad diuretica (%) Sumade Gl Media F Sig. cuadrados cuadratica Inter-grupos 18404,686 4 4601,172 246,491 ,000 Intra-grupos 653,334 35 18,667 Total 19058,020 39 46 Anexo 6 Tabla 7. Prueba de Tukey del porcentaje de la actividad diuretica por efecto de los tratamientos. HSD de Tukey Tratamiento N Subconjunto para alfa = 0.05 1 2 3 4 100 mg/kg 8 40,9588 Blanco 8 45,5188 45,5188 200 mg/kg 8 51,4938 400 mg/kg 8 67,9325 Furosemida 8 100,0000 Sig. ,238 ,064 1,000 1.000 Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos homogeneos. a. Usa el tamano muestral de la media armdnica = 8,000. 47 Anexo 7 Tabla 8. Analisis de varianza de los niveles de sodio por efecto de tratamientos. Na (mEq/l) Suma de cuadrados Gl Media cuadratica F Sig. Inter-grupos 3729,516 4 932,379 12,179 ,000 Intra-grupos 1531,064 20 76,553 Total 5260,580 24 48 Anexo 8 Tabla 9. Prueba de Tukey de los niveles de sodio por efecto de los tratamientos. HSD de Tukey Tratamientos N Subconjunto para alfa = 0.05 1 2 Blanco 5 32,6600 100 mg/kg 5 33,0000 200 mg/kg 5 33,3200 400 mg/kg 5 44,7600 Furosemida 5 64,2600 Sig. ,225 1,000 Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos homogeneos. a. Usa el tamano muestral de la media armdnica = 5,000. 49 Anexo 9 Tabla 10. Analisis de varianza de los niveles de potasio por efecto de los tratamientos. K (mEq/l) Sumade Gl Media F Sig. cuadrados cuadratica Inter-grupos 10,839 4 2,710 ,982 ,440 Intra-grupos 55,202 20 2,760 Total 66,041 24 50 Anexo10 Tabla 11. Prueba de Tukey de los niveles de potasio por efecto de los tratamientos. HSD de Tukey Tratamientos N Subconjunto para alfa = 0.05 1 Furosemida 5 5,8760 400 mg/kg 5 7,0520 Blanco 5 7,2500 200 mg/kg 5 7.4640 100 mg/kg 5 7,8160 Sig. ,376 Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos homogeneos. a. Usa el tamano muestral de la media armbnica = 5,000. 51 Anexo 11 Tabla 12. Analisis de varianza de los niveles de ion cloruro por efecto de los tratamientos. Cl (mEq/l) Sumade Gl Media F Sig. cuadrados cuadratica Inter-grupos 3112,546 4 778,137 14,246 ,000 Intra-grupos 1092,392 20 54,620 Total 4204,938 24 52 Anexo 12 Tabla 13. Prueba de Tukey de los niveles de ion cloruro por efecto de los tratamientos. HSD de Tukey Tratamientos N Subconjunto para alfa = 0.05 1 2 3 Blanco 5 50,6200 100 mg/kg 5 54,9600 54,9600 200 mg/kg 5 62,9000 62,9000 400 mg/kg 5 67,3600 Furosemida 5 82,7000 Sig. ,103 ,098 1,000 Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos homogeneos. a. Usa el tamano muestral de la media armbnica = 5,000. 53 Anexo 13 Extracto seco para reacciones frtoquimicas. Identificacion de metabolitos secundarios. Figura 11. Flujograma del efecto diuretico de! extracto hidroalcohoiico de las hojas de Polylepis racemosa R. & P. "qenoa". 54 Anexo 14 Administracion de los Colocacion a jaulas de diuresis, diferentes tratamientos. u Orina colectada para su envio a Lima, para la determinacion de eiectrolitos. Figura 12. Flujograma del efecto diuretico del extracto hidroalcoholico de las hojas de Polylepis racemosa R. & P. "qenoa". 55 Anexo 15 "abla 14. Matriz de consistencia. TITULO P R O B L L M A OBJETiVOS HIPOTESIS VARIABLES MARCO TEORICO METODOLOGIA Efecto diuretico del extracto hidroalcoholico de las hojas de Polylepis racemosa R. & P. "q-snoa". Ayacucho 2012. iTendra efecto diuretico el extracto hidroalcoholico de las hojas de Polylepis racemosa R. & P. "qenoa"? Objetivo general •Evaluar el efecto diuretico del extracto hidroalcoholico de las hojas de Polylepis racemosa R. & P. "qenoa". Objetivos especificos: •Identificar los metabolitos secundarios presentes en el extracto nidroalcoholico de las hojas de Polylepis racemosa R. & P. "qenoa" mediante tamizaje fitoquimico. •Determinar la concentracion optima diuretica del extracto hidroalcoholico de las hojas de Polylepis racemosa R. & P. "qenoa" •Comparar el efecto diuretico del extracto hidroalcoholico de las hojas de Polylepis racemosa R. & P. "qenoa" con el estandar Furosemida. 'Realizar el dosaje de electrolitos en la orina de cobayos Caw'a Porcellus. El extracto hidroalcoholico de las hojas de Polylepis racemosa R. & P. "qenoa" posee sfecto diuretico. Variable independiente •Extracto hidroalcoholico de las hojas de Polylepis racemosa R. & P. "qenoa". Indicadores •Concentraciones de 100mg/kg, 200mg/kg y 400mg/kg del extracto hidroalcoholico de las hojas de Polylepis racemosa R. & P. "qenoa". Variable dependiente •Efecto diuretico. Indicadores •Porcentaje de volumen de excrecion urinaria •Frecuencia de excrecion urinaria •Variacion de peso corporal de cada unidad experimental. •Cantidad de Electrolitos eliminados en la orina en cobayos. Description botanica Arbol de porte pequefio a mediano. Mide hasta 8 m a 12 m de altura y 20 cm a 40 cm de diametro. Su fuste es irregular y nudoso. Propiedades y usos medicinales. En la curtiembre de los cueros. Para el tenido de prendas de lana y algodon. La corteza interna en infusion para las afecciones respiratorias Antecedentes Existen investigaciones quimicas y farmacologicas tanto de la misma especie como de sus congeneres, entre las que destacan la Actividad diuretica de extractos acuosos de Polylepis australis Bitter (quefioa) y Citotoxicidad por fraccionamiento guiado del extracto de la corteza y del tallo de Polylepis racemosa R. & P. Diureticos. farmacos que actuan sobre los rinones aumentando el volumen urinario al reducir la reabsorcion de sal y agua desde los tubulos Furosemida. Mecanismo de action: actuan inhibiendo la reabsorcion tubular del Na y CI, en el segmento medular y cortical de la rama ascendente gruesa del asa de Henle. Tipo de investigation: Basica experimental Poblacion: Hojas de Polylepis racemosa R. & P. "qenoa" que crecen en el distrito de Quinua, provincia de Huamanga, region Ayacucho. Muestra: 3 kg de hojas de Polylepis racemosa R. & P. "qenoa". Animales de experimentacion: 25 cobayos Caw'a Porcellus, machos de 500 +/- 50 g de peso. Determin.'cion del efecto diuretico. Los animales se dejaran en ayunas 10 a 12 h, sin privarlas de agua. Se administrara VO 50 ml/Kg de NaCI 0.9%. Despues de 20 min de la hidratacion se pesara y administrara el producto en estudio. Se recolectara la orina cada 20 min durante tres horas. Para determinar el efecto, se procedera a pesar los animales inmediatamente despues de haberse producido la diuresis y por diferencia de peso se calculara el volumen perdido; se medira el volumen de orina eliminado, para poder comparar con el efecto producido con ias sustancias diureticas ya conocidas. Analisis estadistico Para la evaluation comparativa de la action diuretica de la sustancia problema se realizara el analisis de varianza (ANOVA) seguido de la prueba de los rangos multiples de Duncan, con el objetivo de determinar las medias que difieren (p<0.05), para cuyo efecto se recurrira al uso del programa S P S S version 20. 56