UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTÓBAL DE HUAMANGA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA Perfil químico, contenido de compuestos fenólicos y potencial antioxidante de las hojas y frutos de Lepidoceras peruvianum Kuijt. Tesis para optar el título profesional de: Químico Farmacéutico Presentado por: Bach. Freshsia Ingrid Ortiz Perez Asesor: Dr. Marco Rolando Aronés Jara Ayacucho - Perú 2024 iii Dedico mi tesis principalmente a Dios, por darme las fuerzas necesarias para lograr está meta. A mis padres por su amor incondicional y por creer en mí desde el primer día, por sus sacrificios y apoyo constante que han sido la clave de mi éxito. A mí hermana, por siempre estar para mi, sabes que este logro también es tuyo. v AGRADECIMIENTO Mi agradecimiento a nuestra “Alma mater” la Universidad Nacional de San Cristóbal de Huamanga y a la Escuela Profesional de Farmacia y Bioquímica de la Facultad de Ciencias de la Salud y a los docentes que contribuyeron en mi formación académica y personal. Mi agradecimiento a mi asesor el Dr. Marco Rolando Aronés Jara por su contribución académica y científica. Mi agradecimiento a todas las personas que contribuyeron en la consecución y culminación de esta investigación. vii ÍNDICE I. INTRODUCCIÓN 1 II. MARCO TEÓRICO 5 2.1. Antecedentes 5 2.2. Redacción del marco teórico 6 2.2.1. Lepidoceras peruvianum Kuijt 6 2.2.2. Plantas parásitas 9 2.2.3. Actividad antioxidante de los compuestos fenólicos 11 2.3. Marco conceptual 16 III. MATERIALES Y MÉTODOS 19 3.1. Ubicación 19 3.2. Tipo de investigación 19 3.3. Definición de la población y muestra 19 3.3.1. Población 19 3.3.1. Muestra 19 3.4. Métodos instrumentales para la recolección de datos 19 3.5. Procedimiento para la recolección de datos 19 3.5.1. Recolección e identificación del material vegetal 19 3.5.2. Determinación del contenido de fenoles totales y flavonoides 20 3.5.3. Determinación del contenido de antocianinas 21 3.5.4. Determinación del potencial antioxidante 21 3.6. Diseño de investigación 23 3.7. Análisis de datos 23 IV. RESULTADOS 25 V. DISCUSIÓN 33 VI. CONCLUSIONES 41 VII. RECOMENDACIONES 43 VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 45 IX. ANEXOS 49 ix ÍNDICE DE TABLAS Pág. Tabla 1. Determinación de compuestos químicos de las hojas de Lepidoceras peruvianum Kuijt mediante LC-MS/MS. Ayacucho 2024. 29 Tabla 2. Determinación de compuestos químicos de los frutos de Lepidoceras peruvianum Kuijt mediante LC-MS/MS. Ayacucho 2024. 30 Tabla 3. Contenido de compuestos fenólicos en las hojas y frutos de Lepidoceras peruvianum Kuijt. Ayacucho 2024. 31 Tabla 4. Actividad antioxidante in vitro de las hojas y frutos de Lepidoceras peruvianum Kuijt. Ayacucho 2024. 32 xi ÍNDICE DE FIGURAS Pág. Figura 1. Fotografía de Lepidoceras peruvianum Kuijt. 06 Figura 2. Descripción botánica de Lepidoceras peruvianum Kuijt. 07 Figura 3. Trímero de procianidina tipo B. 12 Figura 4. Dímero de procianidina tipo B. 12 Figura 5. Siringaresinol diglucósido. 13 Figura 6. Quercetina-3-O-rutinósido. 14 Figura 7. Cianidina-3-O-rutinósido 15 Figura 8. Kaempferol. 16 Figura 9. Cromatograma de corriente iónica total (TIC) en modo ESI negativo (superior) y positivo (inferior) de las hojas de Lepidoceras peruvianum Kuijt. 27 Figura 10. Cromatograma de corriente iónica total (TIC) en modo ESI negativo (superior) y positivo (inferior) de los frutos de Lepidoceras peruvianum Kuijt. 28 xiii ÍNDICE DE ANEXOS Pág. Anexo 1. Identificación taxonómica de Lepidoceras peruvianum Kuijt. 51 Anexo 2. Ubicación del Bosque de Piedras de Huaraca en el Centro Poblado de Huaraca en el distrito de Vinchos, provincia de Huamanga, Departamento de Ayacucho. 52 Anexo 3. Matriz de definición y operacionalización de variables. 53 Anexo 4. Determinación de compuestos químicos de las hojas de Lepidoceras peruvianum Kuijt mediante LC-MS. 54 Anexo 5. Determinación de compuestos químicos de los frutos de Lepidoceras peruvianum Kuijt mediante LC-MS. 55 Anexo 6. Curva de calibración de ácido gálico para la cuantificación de fenoles totales. 62 Anexo 7. Análsis estadístico del contenido de fenoles totales de Lepidoceras peruvianum Kuijt. 63 Anexo 8. Curva de calibración de rutina para la cuantificación de flavonoides. 64 Anexo 9. Análisis estadístico del porcentaje de actividad antioxidante de Lepidoceras peruvianum Kuijt mediante el método DPPH. 65 Anexo 10. Análisis estadístico de la concentración eficiente antioxidante de Lepidoceras peruvianum Kuijt mediante el método DPPH. 66 Anexo 11. Análisis estadístico del porcentaje de actividad antioxidante de Lepidoceras peruvianum Kuijt mediante el método ABTS●+. 67 Anexo 12. Análisis estadístico de la concentración efeciente antioxidante de Lepidoceras peruvianum Kuijt mediante el método ABTS●+. 68 Anexo 13. Análisis estadístico del porcentaje de actividad antioxidante de Lepidoceras peruvianum Kuijt mediante el método FRAP. 69 xiv Anexo 14. Análisis estadístico de la concentración efeciente antioxidante de Lepidoceras peruvianum Kuijt mediante el método FRAP. 70 Anexo 15. Matriz de consistencia. 71 xv RESUMEN Lepidoceras peruvianum Kuijt es una especie hemiparásita endémica del Perú. El objetivo fue determinar la composición química, el contenido de compuestos fenólicos y el potencial actividad antioxidante de las hojas y frutos de Lepidoceras peruvianum Kuijt. La especie vegetal fue recolectada en el distrito de Vinchos en Perú. El perfil químico se evaluó mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS). Los fenoles totales se cuantificaron mediante el método de Folin-Ciocalteu y se expresaron como miligramos equivalentes a ácido gálico (mg GAE/g); los flavonoides mediante el método del tricloruro de aluminio expresados como miligramos equivalentes a rutina (mg RuE/g) y antocianinas por el método de pH-diferencial expresados como miligramos equivalentes a cianidina-3-glicósido (mg/100 g). Se determinó el potencial antioxidante mediante los métodos in vitro DPPH, ABTS•+ y FRAP y fue expresado como actividad antioxidante (%) y concentración eficiente antioxidante (CE50). El análisis LC-MS/MS de las hojas reveló la presencia de carbohidratos, ácidos orgánicos, flavonoides, taninos condensados, lignanos, alcaloides; y en los frutos, ácidos orgánicos, taninos condensados, antocianinas y flavonoides, entre otros compuestos. Las hojas evidenciaron 292,4 ± 2,1 mg GAE/g y 44,0 ± 1,1 mg RuE/g. Los frutos contienen 216,8 ± 3,9 mg GAE/g y antocianinas 120,08 ± 3,6 mg/ 100 g. Las hojas presentaron mayor potencial antioxidante por los tres métodos, con valores de CE50 de 90,6 ± 0,1 µg/mL; 215,1 ± 0,1 µg/mL y 101,2 ± 3,9 µg/mL, respectivamente. Se concluye que las hojas y frutos de Lepidoceras peruvianum contienen compuestos químicos con potencial antioxidante. Palabras clave: Lepidoceras peruvianum, hemiparásita, composición química, LC-MS/MS, compuestos fenólicos, actividad antioxidante in vitro. xvii ABSTRACT Lepidoceras peruvianum Kuijt is a hemiparasitic species endemic to Peru. The objective was to determine the chemical composition, the content of phenolic compounds and the potential antioxidant activity of the leaves and fruits of Lepidoceras peruvianum Kuijt. The plant species was collected in the Vinchos district in Peru. The chemical profile was evaluated by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS/MS). Total phenols were quantified using the Folin-Ciocalteu method and expressed as milligrams equivalent to gallic acid (mg GAE/g); the flavonoids by the aluminum trichloride method expressed as milligrams equivalent to rutin (mg RuE/g) and anthocyanins by the pH-differential method expressed as milligrams equivalent to cyanidin-3-glycoside (mg/100 g). The antioxidant potential was determined using the in vitro DPPH, ABTS•+ and FRAP methods and was expressed as antioxidant activity (%) and efficient antioxidant concentration (EC50). LC-MS/MS analysis of the leaves revealed the presence of carbohydrates, organic acids, flavonoids, condensed tannins, lignans, alkaloids; and in the fruits, organic acids, condensed tannins, anthocyanins and flavonoids, among other compounds. The leaves showed 292.4 ± 2.1 mg GAE/g and 44.0 ± 1.1 mg RuE/g. The fruits contain 216.8 ± 3.9 mg GAE/g and anthocyanins 120.08 ± 3.6 mg/ 100 g. The leaves presented greater antioxidant potential by the three methods, with EC50 values of 90.6 ± 0.1 µg/mL; 215.1 ± 0.1 µg/mL and 101.2 ± 3.9 µg/mL, respectively. It is concluded that the leaves and fruits of Lepidoceras peruvianum contain chemical compounds with antioxidant potential. Keywords: Lepidoceras peruvianum, hemiparasite, chemical composition, LC- MS/MS, phenolic compounds, in vitro antioxidant activity. 1 I. INTRODUCCIÓN Lepidoceras peruvianum Kuijt es una especie hemiparásita endémica del Perú. A decir de Kuijt, es una especie notable, conocida solo por la colección de tipos en Perú y que hasta ahora había escapado a su detección, y que junto a Lepidoceras chilense, son las únicas especies del género Lepidoceras Hooker f., pertenecientes a la familia Eremolepidaceae.1 Ocupa las partes altas de la región Mesoandina, entre los 3500 y 3600 msnm, entre las cuencas del Pampas y Mantaro y que no se encuentra representada en el Sistema Nacional de Áreas Naturales Protegidas por el Estado.2 L. peruvianum, fue recolectada por primera vez por Weberbauer en 1910 en Totorobamba, en la Provincia de Huamanga del Departamento de Ayacucho y posteriormente fue estudiada por Kuijt en 1985, quien realizó su descripción botánica.1,2 En el 2013 fue recolectada por Aronés et al.,3 en el Bosque de Piedras de Huaraca, distrito de Vinchos en Perú. El endemismo es un instrumento importante para determinar y examinar los objetivos y prioridades de una estrategia para la conservación de la biodiversidad biológica. Los endemismos peruanos están vinculados a los Andes y se reconocen un total de 5509 taxones restringidos al Perú y que corresponde a un 27,9% de la flora.2 L. peruvianum solo ha sido reportada en el Perú, y específicamente en la región de Ayacucho, lo que le da un valor incalculable, tanto en la preservación de especies y la conservación de su material genético. Las angiospermas parasitarias son especies que dependen, en diversos grados, de la planta hospedante para la adquisición de agua y solutos; y el movimiento de los recursos ocurre a través de uno o más haustorios, que sirven para unir el parásito al huésped. Las hemiparásitas, como la L. peruvianum, son capaces de fijar una proporción de su carbono de forma autotrófica y también pueden tener una mayor capacidad de asimilar nutrientes inorgánicos.4 Las especies parásitas y hemiparásitas por lo general son agentes patógenos de sus hospedantes y en 2 muchas partes del mundo son serias plagas forestales. Por otro lado, algunas especies han sido utilizadas tradicionalmente para el tratamiento de problemas urológicos, dermatológicos, diabetes, tumores en la piel y como antiséptico.5 El único estudio reportado sobre L. peruvianum fue el publicado por Aronés et al.,3 en el 2022, quienes reportaron que las hojas de L. peruvianum son usadas para la inflamación y el dolor, en forma de decocción y son administradas por vía tópica y que los frutos son comestibles. Evidenciaron que las hojas contienen triterpenos y/o esteroides, quinonas, flavonoides, cardiotónicos, fenoles y/o taninos, saponinas y cumarinas; asimismo, los frutos contienen triterpenos y/o esteroides, flavonoides, fenoles y/o taninos y antocianinas; asimismo, determinaron que esta especie tiene actividad antioxidante. Siguiendo la línea de investigación de esta especie, se pretende evaluar el perfil químico, tanto de las hojas y frutos, ya que permitirá un conocimiento preliminar del comportamiento químico de esta especie. El perfil químico es un instrumento utilizado en la selección de plantas para el estudio.6 Asimismo, se evaluará el contenido de compuestos fenólicos y su actividad antioxidante. Al respecto, el uso de métodos in vitro para evaluar la capacidad antioxidante se recomienda como criterio preliminar para jerarquizar las distintas plantas, extractos o fracciones de éstos, de acuerdo con su poder antioxidante. Así mismo, éstos métodos, a menudo son correlacionados con el contenido de fenoles totales.6 Esta investigación se justifica desde el ámbito tecnológico, ya que el estudio de las plantas hemiparásitas y sus compuestos bioactivos puede ser una fuente de innovación tecnológica para la industria farmacéutica y la biotecnología. La identificación de nuevos compuestos bioactivos y la optimización de los procesos de producción pueden llevar a nuevos medicamentos y terapias para enfermedades que actualmente no tienen tratamientos efectivos. Desde una perspectiva humanística, este estudio puede proporcionar un enfoque natural y no invasivo para el tratamiento de problemas de salud, lo que puede mejorar la calidad de vida de las personas. Los compuestos fenólicos pueden ser utilizados como antioxidantes y estos a su vez para prevenir y tratar diversas enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo, tales como, el cáncer, entre otras. A nivel científico la investigación se justifica, ya que la caracterización química de las hojas y frutos de L. peruvianum permitirá el uso eficaz y seguro de este recurso 3 natural sustentado en la evaluación de su calidad. Entre otros, permite la identificación de los componentes activos y ayuda a comprender cómo estos componentes interactúan con el cuerpo. La caracterización química es importante para establecer estándares de calidad y asegurar su autenticidad y contenga los componentes activos necesarios. La caracterización química es importante para evaluar la seguridad, ya que se pueden evaluar posibles interacciones con otros fármacos, alergias y efectos secundarios; además, algunos componentes pueden ser tóxicos en grandes cantidades. La caracterización química puede ayudar a identificar nuevos componentes y aplicaciones terapéuticas, al conocer la composición química se pueden realizar estudios para evaluar su actividad biológica y establecer su potencial terapéutico. El estudio de especies nativas y endémicas tiene importancia en la conservación no solo de la biodiversidad, sino también, en la conservación del material genético. En ese sentido esta investigación se planteó como problema de investigación: ¿Cuál es perfil químico, el contenido de compuestos fenólicos y la actividad antioxidante de las hojas y frutos de Lepidoceras peruvianum Kuijt? Asimismo, se plantea como objetivo determinar la composición química, el contenido de compuestos fenólicos y potencial actividad antioxidante de las hojas y frutos de Lepidoceras peruvianum Kuijt. Entre los objetivos específicos tenemos: a. Determinar la composición química de las hojas y frutos de Lepidoceras peruvianum Kuijt. mediante LC-MS/MS. b. Determinar el contenido de compuestos fenólicos de las hojas y frutos de Lepidoceras peruvianum Kuijt. c. Evaluar la actividad antioxidante de las hojas y frutos de Lepidoceras peruvianum Kuijt. mediante el método in vitro de DPPH, ABTS•+ y FRAP. 5 II. MARCO TEÓRICO 2.1. Antecedentes Los estudios de Lepidoceras peruvianum Kuijt son escasos y a continuación lo presentamos: Kuijt,1 en 1988, en su publicación “Monografía de Eremolepidaceae”, refiere que Lepidoceras peruvianum Kuijt es una especie hemiparásita endémica del Perú. A decir de Kuijt, es una especie notable, conocida solo por la colección de tipos en Perú y que hasta ese momento había escapado a su detección, y que junto a Lepidoceras chilense, son las únicas especies del género Lepidoceras Hooker f., pertenecientes a la familia Eremolepidaceae. León,2 en el 2006, reportó el estudio de Eremolepidaceae endémicas del Perú. Evidenció que la familia Eremolepidaceae es reconocida en el Perú por presentar dos géneros y tres especies, todos arbustos parásitos. Reconoció un endemismo en el género Lepidoceras y que estas especies ocupan las partes altas de la región Mesoandina, entre los 3500 y 3600 metros de altitud y que no se encuentra representada en el Sistema Nacional de Áreas Naturales Protegidas por el Estado. Respecto a L. peruvianum refiere que es un arbusto parásito descrito de una planta recolectada en 1910, de una localidad entre las cuencas del Pampas y Mantaro. Además, menciona que esta especie, al parecer, no ha vuelto a ser recolectada, tal vez por su hábito y por la poca herborización en esa zona. Por su rango geográfico restringido y el impacto en la zona de la extracción para leña, sus poblaciones podrían estar amenazadas. Aronés et al.,3 en el 2022, reportó el estudio del tamizaje fitoquímico, determinación del contenido de compuestos fenólicos y evaluación del potencial antioxidante de trece plantas medicinales de los afloramientos rocosos del Bosque de Piedras de Huaraca en Perú. Entre las especies incluidas se reportó los resultados del análisis de la hojas y frutos de Lepidoceras peruvianum Kuijt.3. Reportaron que las hojas de L. peruvianum se usan para la inflamación y el dolor, 6 en forma de decocción y se administra por vía tópica.3 Evidenciaron que las hojas contienen triterpenos y/o esteroides, quinonas, flavonoides, cardiotónicos, fenoles y/o taninos, saponinas y cumarinas; asimismo, los frutos contienen triterpenos y/o esteroides, flavonoides, fenoles y/o taninos y antocianinas.3 Las hojas presentaron un contenido de fenoles totales de 292,4 ± 2,1 mg GAE/g y de flavonoides de 44,0 ± 1,1 mg RUE/g. El contenido de antocianinas totales en frutos fue de 1463,6 ± 37,8 mg/100 g expresados en base a cianidina-3-glicósido.3 La actividad antioxidante de las hojas por el método DPPH, a una concentración de 100 µg/mL, fue de 46,3 ± 0,9% con una concentración eficiente de 106,1 ± 0,7 µg/mL. Asimismo, la actividad antioxidante de los frutos, por el método DPPH a una concentración de 100 µg/mL, fue de 19,4 ± 0,51 % y con una concentración eficiente de 761,5 ± 4,11 µg/mL. 2.2. Redacción del marco teórico 2.2.1. Lepidoceras peruvianum Kuijt 2.2.1.1. Clasificación taxonómica y descripción botánica Lepidoceras peruvianum Kuijt fue recolectada por primera vez por Weberbauer en 1910 en Totorobamba, en la Provincia de Huamanga del Departamento de Ayacucho y posteriormente fue estudiada por Kuijt en 1985, quien realizó su descripción botánica.1 En el 2013 fue recolectada por Aronés et al., en el Bosque de Piedras de Huaraca, distrito de Vinchos, Perú,3 y fue identificado en el Museo de Historia Natural de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Anexo 1). Su clasificación taxonómica es: Clase : Equisetopsida C. Agardh Figura 1. Fotografía de Lepidoceras peruvianum Kuijt. Subclase : Magnoliidae Novák ex Takht. Superorden : Santalanae Thorne ex Reveal Orden : Santalales R. Br. ex Bercht. & J. Presl Familia : Santalaceae R. Br. Género : Lepidoceras Hook. F 7 Especie : Lepidoceras peruvianum Kuijt, Nombre vulgar : “tullma” Lepidoceras peruvianum Kuijt es una especie hemiparásita endémica del Perú. A decir de Kuijt, es una especie notable, conocida solo por la colección de tipos en Perú y que hasta ahora había escapado a su detección, y que junto a Lepidoceras chilense, son las únicas especies del género Lepidoceras Hooker f., pertenecientes a la familia Eremolepidaceae.1 León,2 refiere que L. peruvianum es una planta endémica del género Lepidoceras, que ocupa las partes altas de la región Mesoandina, entre los 3500 y 3600 msnm, entre las cuencas del Pampas y Mantaro y que no se encuentra representada en el Sistema Nacional de Áreas Naturales Protegidas por el Estado. L. peruvianum es una planta parva, densifoliata, erecta; filotaxis opuesta; internodio ancho de 1 cm de largo; folia sat carnosa, sessilia, calloso- apiculata. Flores monoici, en spicis diversis; semen exalbuminoso; embrión sphaeroideus, cotyledonibus nullis. Plantas pequeñas, densamente ramificadas con ramas rígidas, que se vuelven quebradizas cuando se secan; tallos minuciosamente verrugosos /papilados, los más viejos, sin c d Figura 2. Descripción botánica de Lepidoceras peruvianum Kuijt. a. Hábito; b. Inflorescencia masculina; c. Flores masculinas; d) Espiga femenina; e) Fruto maduro; f) Embrión. hojas, parecen espinosos debido a las brácteas persistentes en los nudos; filotaxia decusada en todas partes. Entrenudos de 1 cm o menos de largo, alrededor de 1 mm de espesor cuando tienen hojas; ramificado percurrente, pero estacional, formándose una yema latente al final del crecimiento de la temporada. Hojas de hasta 11 mm de largo y 3 mm de ancho, anchas en forma de punzón a estrechamente ovadas, sésiles, gruesas, márgenes enrollables cuando están secas, nervadura oscura; cada hoja con una "uña" esclerótica terminal prominente, lisa, aguda, oscura; esta estructura es relativamente más prominente en las primeras hojas, las primeras hojas aparentemente expanden ligeramente b f a e 8 las escamas de las yemas; base de la hoja algo gibosa/saca. Monoico. Inflorescencia en racimo (macho) o espiga (hembra) axilar, corta, sésil, unisexual, indeterminada, revestida de varios pares de hojas de escamas decusadas, en su mayoría con 4 o 5 flores por inflorescencia, las hojas de escamas caducas en el macho, posiblemente persistentes en la hembra. Flores masculinas en racimo indeterminado con un eje de aproximadamente 1 mm de largo, brácteas deciduas/caducas, cada flor de pedúnculo corto, 4-partidas, pétalos triangulares, cada uno con una antera de 4 lóbulos en un filamento libre muy corto, centro de la flor con disco pequeño, débilmente de 4 lóbulos. Flores femeninas sésiles, ovario inferior, cerca de 1 mm de largo, menos de 0,5 mm de ancho y afinándose hacia abajo; pétalos 4, de 0,5 mm de largo, triangulares, colocados sobre una ligera constricción, rodeando un disco del centro del cual se eleva el estilo robusto (0,5 mm de largo); estigma pobremente diferenciado, débilmente de 4 lóbulos. Fruto de 3,5 mm de largo, 2,5 mm de ancho, de contorno elíptico, pétalos y estilo persistentes; embrión una estructura indiferenciada, globular, acótila, ovoide de aproximadamente 1,5 mm de largo. Número de cromosomas desconocido.1 Aunque la morfología y filotaxia de sus hojas, junto con la falta de endospermo, indican claramente una posición sistemática en Lepidoceras, esta especie muestra diferencias significativas con L. chilense. Entre estos, la presencia de una inflorescencia femenina escamosa claramente definida es muy importante, pero más aún lo es el embrión indiferenciado, una condición que invita a especular sobre la germinación y la producción de brotes en base a una comparación con Tristerix aphyllus (de Candolle) Barlow & Wiens (Loranthaceae). Esta última es la única otra especie conocida de muérdago con un embrión acotilar, y se dispone de mucha más información. En esa especie, el polo de la raíz de la radícula crece para adherirse eventualmente a la superficie del huésped por medio de un disco haustorial expandido; a partir de este disco se produce la penetración. El polo cotiledonario de la plántula nunca emerge del endospermo. De hecho, toda la plántula y el disco mueren y se marchitan al penetrar con éxito, y todos los brotes aéreos se derivan accidentalmente de hebras endófitas. Por lo tanto, es completamente posible que L. peruvianum haya desarrollado independientemente un patrón de crecimiento similar. Es de esperar que la especie sea recolectada nuevamente por un observador que preste atención a la distribución de los brotes en la superficie del huésped y otros detalles relacionados. Mientras tanto, existe la posibilidad de que esta plántula simplemente represente una condición extrema 9 de la que se ve en Eubrachion, donde los cotiledones también son muy pequeños; por lo tanto, la germinación y el establecimiento pueden ser tan simples como en ese género.1 La espiga femenina parece proporcionar un vínculo sistemático con Antidaphne; de manera similar, la condición monoica de Lepidoceras peruvianum es comparable a la de A. schottii. Por lo tanto, podemos considerar a L. peruvianum como una especie de puente entre L. chilense y el género Antidaphne. Aunque la ubicación en ese género no es apropiada, el descubrimiento de L. peruvianum agrega una unidad considerable a la familia como un todo.1 2.2.1.2. Usos tradicionales Las hojas de L. peruvianum se usan para la inflamación y el dolor, en forma de decocción y se administra por vía tópica.3 Los pobladores consumen los frutos como alimento.3 2.2.1.3. Composición química Las hojas contienen triterpenos y/o esteroides, quinonas, flavonoides, cardiotónicos, fenoles y/o taninos, saponinas y cumarinas; asimismo, los frutos contienen triterpenos y/o esteroides, flavonoides, fenoles y/o taninos y antocianinas.3 Las hojas presentan un contenido de fenoles totales de 292,4 ± 2,1 mg GAE/g y de flavonoides de 44,0 ± 1,1 mg RUE/g. El contenido de antocianinas totales en frutos fue de 1463,6 ± 37,8 mg/100 g expresados en base a cianidina-3-glicósido.3 2.2.1.4. Actividad antioxidante Se ha demostrado la actividad antioxidante de las hojas de L. peruvianum por el método DPPH. Sus hojas presentan una actividad antioxidante de 46,3 ± 0,9% una concentración de 100 µg/mL y una concentración eficiente de 106,1 ± 0,7 µg/mL. Asimismo, la actividad antioxidante de los frutos, por el método DPPH a una concentración de 100 µg/mL, fue de 19,4 ± 0,51 %,con una concentración eficiente de 761,5 ± 4,11 µg/mL.3 2.2.2. Plantas parásitas Las plantas parásitas son plantas que se adhieren y se alimentan de otras plantas usando una estructura parásita llamada haustorio. El haustorio es un órgano multicelular especializado homólogo a una raíz, que penetra en un huésped, establece una conexión vascular y facilita la transferencia de nutrientes y otras moléculas. Aproximadamente 4530 de las 369 000 especies de plantas con flores (1,2 %) son parásitas, y el parasitismo evoluciona al menos 12 veces entre las 10 angiospermas. Son extremadamente diversos desde el punto de vista morfológico y van desde plantas herbáceas diminutas hasta árboles grandes, así como parásitos muy reducidos que crecen incrustados en su huésped y carecen de hojas y raíces. Las plantas parásitas se pueden dividir en función de si son fotosintéticamente activas (hemiparásitos) o carecen de actividad fotosintética y dependen completamente de un huésped para el carbono (holoparásitos), si son parásitos facultativos u obligados, y si se adhieren a las raíces o al tallo del huésped. 5 Las plantas parásitas pueden tener un efecto perjudicial, así como benéfico. Pueden afectas los sistemas naturales y agrícolas, reducir la productividad del hospedero. Sin embargo, pueden actuar como ingenieros de ecosistemas que suprimen el crecimiento de plantas competitivamente dominantes y ayudan a mantener la diversidad de especies, y se utilizan en proyectos de restauración de pastizales. También se usan en horticultura con fines turísticos, por ejemplo, Raffesia arnoldi produce las flores más grandes del mundo.5 Las plantas parásitas también han sido de interés terapéutico, tal como, se evidencia en Viscum album7 y Ligaria cuneifolia,8 entre otros. La actividad antioxidante de las plantas hemiparásitas se ha estudiado en diferentes especies, y se ha encontrado que muchas de ellas poseen compuestos con actividad antioxidante. Los antioxidantes son sustancias que protegen a las células del daño causado por los radicales libres, que se producen como resultado del metabolismo normal del cuerpo, pero también debido a factores ambientales como la exposición a la radiación solar, la contaminación y el tabaquismo. Entre las especies de plantas hemiparásitas estudiadas, se encuentran Viscum album que es una especie europea7, y de Ligaria cuneifolia que es una especie de nativa de lationamericana.8 En estudios in vitro se ha demostrado que extractos de estas plantas poseen actividad antioxidante y pueden proteger a las células de la oxidación.7–9 Además, algunos estudios han sugerido que las plantas hemiparásitas pueden contener compuestos con actividad anticancerígena. Sin embargo, es importante señalar que la actividad antioxidante y anticancerígena de las plantas hemiparásitas puede variar según la especie y la parte de la planta que se utilice, así como la forma de extracción y preparación del extracto. Por lo tanto, se necesitan más estudios para determinar las propiedades específicas de cada especie y su potencial uso en la medicina y la industria. 11 2.2.3. Actividad antioxidante de los compuestos fenólicos Los compuestos fenólicos son conocidos por sus propiedades antioxidantes debido a su capacidad para neutralizar los radicales libres y reducir el estrés oxidativo en el cuerpo. Estos compuestos se encuentran en una amplia variedad de alimentos, incluyendo frutas, verduras, granos enteros, té y vino. Los compuestos fenólicos pueden reducir el estrés oxidativo en el cuerpo humano y mejorar la salud en general. Los alimentos ricos en compuestos fenólicos, como las frutas y verduras, deberían formar parte de una dieta saludable y equilibrada para maximizar los beneficios antioxidantes.10 La ingesta de compuestos fenólicos está inversamente asociada con el riesgo de enfermedad cardiovascular, cáncer y otras enfermedades crónicas y su consumo puede reducir el riesgo de enfermedades crónicas.11,12 En general, estos estudios y muchos otros han demostrado que los compuestos fenólicos tienen una actividad antioxidante significativa y que su consumo puede tener efectos beneficiosos para la salud en general. Es importante consumir una variedad de alimentos ricos en compuestos fenólicos como parte de una dieta saludable y equilibrada para maximizar estos beneficios. El mecanismo de acción de la actividad antioxidante de los compuestos fenólicos ha sido ampliamente investigado en la literatura científica. Se cree que estos compuestos actúan mediante una variedad de mecanismos, incluyendo la neutralización de los radicales libres, la quelación de metales pesados y la estimulación de enzimas antioxidantes endógenas. Los compuestos fenólicos actúan principalmente mediante la neutralización de los radicales libres y la quelación de metales pesados, aunque también pueden estimular la producción de enzimas antioxidantes endógenas en el cuerpo.13 Por ejemplo, el ácido ferúlico actúa mediante la neutralización de los radicales libres y la quelación de metales pesados, y también puede estimular la producción de enzimas antioxidantes endógenas en el cuerpo.14 Los compuestos fenólicos actúan mediante una variedad de mecanismos, incluyendo la neutralización de los radicales libres, la inhibición de la oxidación lipídica y la estimulación de la producción de enzimas antioxidantes endógenas.15 12 El trímero de procianidina tipo B es un tipo específico de procianidina, que es una clase de compuestos fenólicos encontrados en una variedad de plantas. Las procianidinas son un tipo de taninos condensados y forman parte de los polifenoles, conocidos por sus propiedades antioxidantes. Estos compuestos contribuyen a la salud humana de varias maneras, incluyendo la protección contra enfermedades cardiovasculares y ciertos tipos de Figura 3. Trímero de procianidina tipo B. cáncer, así como la modulación del sistema inmunológico.16 Los trímeros de procianidina tipo B están compuestos por tres unidades de catequinas (un tipo de flavonoides) unidas entre sí. Estas estructuras pueden variar dependiendo de la forma en que las unidades de catequinas están enlazadas. Las procianidinas se encuentran en una amplia gama de alimentos y bebidas, incluyendo el vino tinto, las manzanas, el chocolate, las uvas, y el té, entre otros. Debido a sus efectos antioxidantes, se ha investigado el papel de las procianidinas en la prevención de diversas enfermedades crónicas, así como en la mejora de la salud cardiovascular y la función endotelial.16 El dímero de procianidina tipo B es un compuesto polifenólico perteneciente a la clase de las procianidinas, que son un tipo de taninos condensados encontrados en diversas plantas. Este compuesto se caracteriza por la unión de dos monómeros de catequina, un tipo de flavonoide, a través de enlaces específicos que forman una Figura 4. Dímero de procianidina tipo B. estructura dímera. Las procianidinas, incluidos los dímeros de tipo B, son conocidas por sus potentes propiedades antioxidantes, contribuyendo a la protección contra el estrés oxidativo y la inflamación, factores asociados con diversas enfermedades crónicas.16 13 Los dímeros de procianidina tipo B se encuentran en varios alimentos y bebidas, tales como el vino tinto, el chocolate, las manzanas, las uvas y el té. Estos compuestos han sido objeto de estudio debido a su capacidad para beneficiar la salud humana, incluyendo la mejora de la salud cardiovascular, la protección contra ciertos tipos de cáncer, y la modulación de la respuesta inmunitaria. También se investiga su papel en la mejora de la función endotelial y en la reducción de la presión arterial.16 El siringaresinol diglucósido (SDG) es un lignano, un tipo de fitoquímico que se encuentra principalmente en semillas de lino (Linum usitatissimum), así como en otras plantas y alimentos como el sésamo, ciertas frutas, vegetales y cereales. Los lignanos son conocidos por su actividad antioxidante y por su capacidad de actuar como fitoestrógenos, es decir, compuestos vegetales capaces de ejercer efectos similares a los estrógenos en el cuerpo humano.17 Figura 5. Siringaresinol diglucósido. El SDG ha sido objeto de interés científico debido a sus potenciales beneficios para la salud. La investigación sugiere que puede tener varios efectos positivos, incluyendo:  Propiedades antioxidantes: El SDG puede ayudar a proteger las células contra el daño causado por los radicales libres, sustancias que están implicadas en el desarrollo de enfermedades crónicas como enfermedades cardiovasculares y cáncer.17  Efectos sobre la salud cardiovascular: Se ha sugerido que el SDG puede contribuir a mejorar la salud cardiovascular mediante la reducción de los niveles de colesterol, la presión arterial y la inflamación.17  Potencial anticancerígeno: Algunos estudios han indicado que el SDG podría tener propiedades anticancerígenas, particularmente en lo que respecta a la prevención de ciertos tipos de cáncer, como el de mama y el de próstata, posiblemente debido a su capacidad para influir en el metabolismo de los estrógenos.17 14  Efectos sobre la salud ósea: El SDG también podría tener un papel en la protección contra la osteoporosis, especialmente en mujeres postmenopáusicas, gracias a sus efectos fitoestrogénicos.17 No obstante, a pesar de estos posibles beneficios, es importante destacar que la mayoría de las investigaciones sobre el siringaresinol diglucósido se han realizado en modelos animales o in vitro. Por lo tanto, se necesita más investigación, especialmente estudios en humanos, para confirmar su seguridad y eficacia como suplemento o tratamiento para diversas condiciones de salud. La quercetina-3-O-rutinósido, más conocida como rutina, es un flavonoide natural presente en una amplia variedad de plantas, incluyendo frutas y verduras como los cítricos, las bayas, las manzanas, y el trigo sarraceno, entre otros. La rutina es un glucósido de la quercetina, lo que significa que la molécula de Figura 6. Quercetina-3-O-rutinósido. quercetina está unida a un azúcar (rutinosa en este caso), lo que afecta su solubilidad y absorción en el cuerpo humano.18 Este compuesto posee múltiples propiedades beneficiosas para la salud, incluyendo actividad antioxidante, antiinflamatoria, antitrombótica, y vasoprotectora. Las investigaciones sugieren que la rutina puede ayudar a fortalecer los vasos sanguíneos, mejorar la circulación, y reducir la permeabilidad capilar, lo que la hace útil en el tratamiento de venas varicosas y hemorroides, así como en la prevención de trombosis.18 Además de sus efectos sobre el sistema circulatorio, la rutina ha demostrado tener potencial para proteger contra ciertas enfermedades crónicas, como enfermedades cardiovasculares, ciertos tipos de cáncer, y trastornos inflamatorios. También se ha investigado su capacidad para mejorar la absorción y efectividad de otros antioxidantes, como la vitamina C.18 A pesar de estos beneficios potenciales, la investigación sobre la rutina y su efectividad en humanos sigue siendo limitada, y se requieren más estudios clínicos para establecer dosis efectivas, seguridad a largo plazo, y mecanismos de acción específicos.18 15 El buddlenol D 4-O-glucopiranósido es un compuesto específico que pertenece a la clase de los glucósidos fenólicos, sustancias químicas naturales encontradas en algunas plantas. Este tipo de compuesto se caracteriza por la presencia de un grupo fenólico unido a una molécula de glucosa mediante un enlace glucosídico, específicamente en la posición 4 del anillo de glucopiranósido. Los glucósidos fenólicos, como el buddlenol D 4-O-glucopiranósido, tienen varias propiedades importantes, incluyendo actividades antioxidantes, antiinflamatorias, y potencialmente antimicrobianas, entre otras. Estas sustancias pueden jugar un papel significativo en la protección de las plantas contra patógenos y estrés ambiental, y también ofrecen beneficios potenciales para la salud humana cuando se consumen en la dieta a través de plantas medicinales, frutas, verduras, y otros alimentos vegetales. Sin embargo, la información específica sobre el buddlenol D 4-O-glucopiranósido, incluyendo su fuente exacta, actividad biológica, y aplicaciones potenciales, puede ser limitada en la literatura científica disponible, ya que la investigación sobre muchos compuestos naturales específicos es a menudo preliminar o no tan extensa como la investigación sobre compuestos más conocidos y estudiados. En general, el estudio de los glucósidos y otros fitoquímicos continúa siendo un área de interés para la ciencia debido a su potencial para descubrir nuevos tratamientos y beneficios para la salud basados en recursos naturales. La cianidina-3-O-rutinósido es un tipo de glucósido flavonoide, un compuesto químico natural que se encuentra en ciertas plantas. Pertenece a la clase de las antocianinas, que son pigmentos responsables de los colores rojos, púrpuras y azules en muchas frutas, verduras, granos y flores. Las antocianinas, incluyendo la cianidina-3-O-rutinósido, son conocidos por sus propiedades antioxidantes, lo que significa que pueden ayudar a proteger las células contra el daño Figura 7. Cianidina-3-O-rutinósido. causado por los radicales libres, moléculas inestables que pueden contribuir al envejecimiento y a diversas enfermedades.17 La cianidina-3-O-rutinósido, en particular, se ha estudiado por sus potenciales beneficios para la salud, incluyendo la mejora de la función visual, la protección 16 cardiovascular y la regulación del metabolismo de la glucosa, aunque la evidencia científica aún está en desarrollo y se requiere más investigación para comprender completamente sus efectos y mecanismos de acción. Este compuesto se encuentra en alimentos como las bayas (por ejemplo, moras, arándanos, frambuesas), algunas verduras, vinos tintos y tés, contribuyendo no solo a sus vibrantes colores sino también a sus beneficios nutricionales y potencial terapéutico.17 El kaempferol-3-O-hexosil-3''- desoxihexósido es un compuesto bioactivo perteneciente a la clase de los flavonoides, específicamente un tipo de glucósido de kaempferol. Los flavonoides son una amplia clase de fitonutrientes (nutrientes de las plantas) Figura 8. Kaempferol. conocidos por sus propiedades antioxidantes, antiinflamatorias y protectoras contra diversas enfermedades. El kaempferol es un flavonol, un subgrupo de los flavonoides, y se encuentra en una amplia variedad de plantas, incluidas frutas, verduras, té, y vino. La presencia y el tipo de azúcar(s) adjunto(s) pueden influir significativamente en las propiedades biológicas del compuesto, incluyendo su solubilidad, estabilidad, absorción y metabolismo en el cuerpo humano, así como sus efectos sobre la salud.19 El kaempferol y sus glucósidos han sido estudiados por sus potenciales beneficios para la salud, que incluyen actividades anticancerígenas, cardioprotectoras, antiinflamatorias, y neuroprotectoras. Sin embargo, el kaempferol-3-O-hexosil-3''- desoxihexósido en particular es un compuesto más específico y menos común, y podría requerir investigación científica adicional para comprender completamente sus efectos específicos y mecanismos de acción.19 2.3. Marco conceptual Hemiparásitas. Son especies vegetales parásitas fotosintéticamente activas.5 Especie endémica. Una especie vegetal endémica es una planta que se encuentra únicamente en una región geográfica específica y no se encuentra de manera natural en ningún otro lugar del mundo.20 Radical DPPH. Es el 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo.6 Radical ABTS. Es el Acido2,2´-azino-bis-(3-etilbenzotiazolina)-6-sulfónico.6 17 Radical FRAP. Es el radical formado por un complejo férrico-2,4,6-tripiridil-s- triazina.6 Perfil químico. El perfil químico se refiere a la composición química de una sustancia, que puede incluir información sobre sus componentes, su concentración, su estructura molecular y sus propiedades físicas y químicas. 21 Potencial antioxidante. El potencial antioxidante se refiere a la capacidad de una sustancia para proteger a las células del daño causado por los radicales libres, que son moléculas inestables y altamente reactivas que pueden dañar las células y contribuir al desarrollo de diversas enfermedades.22 19 III. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Ubicación La investigación se realizó en los laboratorios del Centro de Desarrollo, Análisis y Control de Calidad de Medicamentos y Fitomedicamentos de la Escuela Profesional de Farmacia y Bioquímica de la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad Nacional de San Cristóbal de Huamanga. 3.2. Tipo de investigación El tipo de investigación es básica, ya que está orientado a conocer la composición química y potencial actividad antioxidante de las hojas y frutos de Lepidoceras peruvianum Kuijt. 3.3. Definición de la población y muestra 3.3.1. Población Hojas y trutos de Lepidoceras peruvianum Kuijt. que crece de manera silvestre en el Bosque de Piedras de Huaraca. 3.3.1. Muestra 200 gramos de hojas y frutos de Lepidoceras peruvianum Kuijt. 3.4. Métodos instrumentales para la recolección de datos El perfil químico se evaluó por cromatografía líquida acoplada a espectroscopía de masas (LC-MSMS). El contenido de fenoles se evaluó por el método de Folin Ciocalteu, flavonoides por el método de tricloruro de aluminio y las antocianinas por el método pH-diferencial. La evaluación de la actividad antioxidante por los métodos DPPH, ABTS●+ y FRAP se realizó mediante el método espectrofotométrico. 3.5. Procedimiento para la recolección de datos 3.5.1. Recolección e identificación del material vegetal L. peruvianum fue recolectado en el anexo de Huaraca del centro poblado de Anchacchuasi del distrito de Vinchos, Provincia de Huamanga del Departamento de Ayacucho, en el lugar conocido como Bosque de Piedras de Huaraca. Las 20 coordenadas geográficas son 13°18'58.9" latitud sur, 74°26'55.8" longitud oeste y una altitud de 3627 msnm. Se confeccionó un herbario del material vegetal para su identificación y depósito respectivo en el Museo de Historia Natural de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. (Anexo 1) Para la evaluación del perfil químico por LC-MS, se liofilizaron 20 gramos de hojas y frutos utilizando un liofilizador Labcom a -42 °C y 0,013 mbar durante 48 h y se remitió a la Unidad de Investigación en Productos Naturales de la Universidad Peruana Cayetano Heredia. Para la evaluación de la actividad antioxidante 200 g de las hojas y frutos se secaron a la sombra y luego en una estufa a 40 °C; posteriormente se pulverizaron con un molino y se almacenaron en envases de vidrio herméticamente cerrados hasta su análisis en el Laboratorio de Control de Calidad del CEDACMEF. 3.5.2. Determinación del contenido de fenoles totales y flavonoides 3.5.2.1. Preparación del extracto hidroalcohólico El extracto de las hojas fue obtenido por percolación, usando como solvente etanol de 70°. El extracto fue filtrado y luego concentrado en un Rotavapor R-3000 a 40 °C. El extracto hidroalcohólico seco se obtuvo utilizando el Mini Spray Dryer B-290 a una temperatura de entrada de 120 °C, velocidad de flujo 2 mL/min y aspiración 100%.3 3.5.2.2. Contenido de fenoles totales El contenido de fenoles totales (TPC) fue determinado colorimétricamente usando el reactivo de Folin-Ciocalteu (RFC).23 Se preparó una solución madre de 320 µg/mL del extracto por triplicado. Se midió 100 µL de cada solución y se adicionará 500 µL de RFC (1:10) y 400 µL de Na2CO3 7,5 %. Transcurrido 30 min se midió la absorbancia a 765 nm. La concentración se calculó a partir de una curva patrón de ácido gálico (y = 0,01x + 0,0262; r = 0,999) y el TPC es expresado en miligramos equivalentes de ácido gálico por gramo de extracto seco (mg GAE/g). 3.5.2.3. Contenido de flavonoides Para la cuantificación de flavonoides (TFC) se utilizó el método colorimétrico de tricloruro de aluminio.6 Se preparó una solución de 800 µg/mL del extracto por triplicado. Se midió 2,0 mL de cada solución y se adicionó 0,5 mL de AlCl3 2% y se completó a volumen de 5,0 mL con etanol 50°. Después de 30 min se midió las absorbancias a 415 nm. La concentración se calculó a partir de una curva patrón 21 de rutina (y = 0,0259x + 0,0044; r = 0,998) y el TFC es expresado en miligramos equivalentes de rutina por gramo de extracto seco (mg RUE/g). 3.5.3. Determinación del contenido de antocianinas 3.5.3.1. Preparación del extracto de antocianinas Se pesó 15 g de fruto liofilizado y se maceró por 24 h en 200 mL de etanol 70° acidulado con ácido cítrico a pH 3,3; el macerado se filtró y luego concentró en un rotavapor a 40 °C. El extracto fue liofilizado a -42 °C y 0,013 mbar durante 48 h. 3.5.3.2. Cuantificación de antocianinas El contenido de antocianinas (TAC) se determinó por el método de pH- diferencial.24 Se preparó una solución de extracto de 10 mg/mL en etanol 70°, a partir del cual se preparó una solución de 1 mg/mL en buffer pH 1,0 y otra en buffer pH 4,5 por triplicado. Se midió las absorbancias a 520 nm y 720 nm, usando como blanco las soluciones buffer respectivas. Se calculó el TAC como equivalentes a cianidina-3-glicósido (mg/100 g), a partir de la Ecuación (1). TAC(mg. 100 g−1) = ( A∗×PM × Vmp(mL) ) × 100 Ecuación (1) 𝗌×l Wmp(mL) donde, A*: diferencia de absorbancias en las dos longitudes de onda; PM: peso molecular para cianidina-3-glicósido (449,2 g mol); FD: factor de dilución; ɛ: coeficiente de extinción molar para cianidina-3-glicósido (26900 L/mL.cm); l: longitud de paso de celda (1 cm). 3.5.4. Determinación del potencial antioxidante 3.5.4.1. Determinación de la capacidad antioxidante por el método DPPH La evaluación del potencial antioxidante se realizó monitoreando el consumo del radical libre DPPH por las muestras, a través de la disminución de las absorbancias de las soluciones a diferentes concentraciones y teniendo como control positivo al Trolox.6,23 En primer lugar, se construyó una curva de calibración de DPPH, para lo cual se preparó 250 mL de solución de DPPH en metanol a una concentración de 40 µg/mL, mantenida en refrigeración y protegida de la luz. Se obtuvo diluciones de 1 a 35 µg/mL. La curva de calibración fue construida con los valores de absorbancia leídos a 515 nm de todas las soluciones por triplicado (1 a 40 µg/mL), utilizando como blanco el metanol. En segundo lugar, se prepararon soluciones de los extractos y el control positivo Trolox en etanol de 96° a una concentración de 500 µg/mL a partir de los cuales se prepararon diluciones de 25 a 250 µg/mL en metanol. Se midió 300 µL de cada dilución y se adicionó 2,7 mL de solución de DPPH (40 µg/mL). Después de 30 22 min se midió la absorbancia a 515 nm, calibrando el espectrofotómetro con el blanco (300 µL de agua y 2,7 mL de DPPH). A partir de la curva de calibración de DPPH se determinó los porcentajes de DPPH remanentes (%DPPHREM) a partir de la Ecuación (2). %DPPH REM = [DPPH]T=t [DPPH]T=0 Ecuación (2) Donde [DPPH]T=t corresponde a la concentración de DPPH en el medio después de la reacción con el extracto y el control positivo y [DPPH]T=0 es la concentración inicial de DPPH. La concentración eficiente, cantidad de antioxidante necesaria para disminuir la concentración inicial de DPPH en 50 % (CE50), fue determinada utilizando el software OriginPro 8, a partir de una curva exponencial (𝑦 = 𝑦0 + 𝐴𝑒𝑅0.𝑥) obtenida de los valores del porcentaje de DPPH remanente en función de la concentración de la muestra (µg/mL) o del control positivo. Los porcentajes de actividad antioxidante (%AA) se calcularon a partir de la Ecuación (3): AA(%) = [((Ac) − (Am − Ab))⁄(Ac)] × 100 Ecuación (3) donde Ac es la absorbancia inicial de la solución metanólica de DPPH; Am es la absorbancia de la mezcla de reacción (DPPH + muestra) y Ab es la Absorbancia del blanco. La comparación del %AA se realizó con los valores obtenidos a la concentración 100 µg/mL. 3.5.4.2. Determinación de la capacidad antioxidante por el método ABTS La reacción del radical ABTS●+ se realizó según lo descrito por Rivas et al.6 Se preparó una solución de radical ABTSo+, mezclando 3 mL de una solución de ABTS 7 uM y 3 mL de una solución de persulfato de potasio 2,45 nM. Se incubó la solución durante 16 horas a temperatura ambiente y se diluyó con etanol 96° hasta obtener una absorbancia de 0,70 ± 0,2 a 734 nm. Se preparó diluciones del extracto y el control positivo (Trolox) a concentraciones de 25 a 250 µg/mL en etanol de 96° a partir de una solución de 500 µg/mL. Se tomaron alícuotas de 20 µL de cada dilución y se adicionó 980 mL de solución de radical ABTSo+, se reposó por 7 minutos y midió la absorbancia a 734 nm calibrando el espectrofotómetro con el blanco (20 µL de agua, 980 µL de solución de radical ABTSo+). El porcentaje de actividad antioxidante se calculó por la Ecuación (4): AA (%) = [(Ac − (Am − Ab))⁄(Ac)] × 100 23 Donde Ac es la absorbancia del control; Am es la absorbancia del extracto y/o Trolox y Ab es la absorbancia del blanco. La comparación del %AA se realizó con los valores obtenidos a la concentración 100 µg/mL. La concentración eficiente (CE50) se calculó utilizando el software OriginPro 8, a partir de una curva exponencial (y = bx + a) obtenida de los valores del porcentaje de AA (%) en función de la concentración del extracto (µg/mL) o del Trolox. 3.5.4.3. Determinación de la capacidad antioxidante por el método FRAP El ensayo FRAP se realizó según lo descrito por Rivas et al.6 Se preparó el reactivo de FRAP mezclando 25 mL de tampón acetato 0,3 mM con 2,5 mL de 2,4,6-Tris(2- pyridyl)-s-triazine 10 mM preparado en HCl 40 mM y 2,5 mL de FeCl3.6H2O 20 mM. El reactivo de FRAP se mantuvo en baño maría a 37°C durante el ensayo. Se prepararon diluciones del extracto y el control positivo (Trolox) a concentraciones de 25 a 250 µg/mL en etanol de 96° a partir de una solución de 500 µg/mL. Se midieron alícuotas de 20 µL de cada dilución y se adicionó 980 µL de reactivo FRAP y se dejó reposar por 30 minutos. Se midió la absorbancia a 593 nm, calibrando el espectrofotómetro con el blanco (20 µL de agua, 980 µL de reactivo FRAP). El porcentaje de actividad antioxidante se calculó por la Ecuación (4). La comparación del %AA se realizó con los valores obtenidos a la concentración 100 µg/mL. La concentración eficiente (CE50) se calculó utilizando el software OriginPro 8, a partir de una curva exponencial (y = b.x + a) obtenida de los valores del porcentaje de AA (%) en función de la concentración del extracto (µg/mL) o del Trolox. 3.6. Diseño de investigación El diseño de investigación para la determinación del perfil químico y contenido de compuestos fenólicos es transeccional descriptivo y para la evaluación de la actividad antioxidante es experimental puro con grupo control.25 3.7. Análisis de datos Los datos obtenidos se expresan en forma de medias y desviación estándar de tres repeticiones. Los resultados se presentan mediante tablas y figuras. Los promedios se compararon mediante análisis de varianza y de comparaciones múltiples de Tukey con un nivel de confianza del 95%.25,26 25 IV. RESULTADOS 27 Figura 9. Cromatogramas de corriente iónica total (TIC) en modo ESI negativo (superior) y positivo (inferior) de las hojas de Lepidoceras peruvianum Kuijt. Ayacucho 2024. 28 Figura 10. Cromatogramas de corriente iónica total (TIC) en modo ESI negativo (superior) y positivo (inferior) de los frutos de Lepidoceras peruvianum Kuijt. Ayacucho 2024. 29 Tabla 1. Determinación de compuestos químicos de las hojas de Lepidoceras peruvianum Kuijt mediante LC-MS/MS. Ayacucho 2024. N° tR (min) MS-ESI- MS-ESI+ Masa nominal Fórmula molecular Estructura tentativa 1 1,64 175,1191 174 C6H14N4O2 Arginina 2 1,8 181,0712 182 C6H14O6 Manitol 3 1,81 341,1089 342 C12H22O11 Sacarosa 4 2,05 308,0911 307 C10H17N3O6S Glutatión 5 2,07 133,0134 134 C4H6O5 Ácido málico 6 2,14 268,1042 267 C10H13N5O4 Adenosina 7 2,19 133,0134 134 C6H8O7 Citrato 8 3,57 577,1357 579,1501 578 C30H26O12 Dímero de procianidina tipo B (isómero 1) 9 5,69 577,1354 579,1501 578 C30H26O12 Dímero de procianidina tipo B (isómero 2) 10 6,9 577,135 579,1496 578 C30H26O12 Dímero de procianidina tipo B (isómero 3) 11 7,6 289,0717 291,0862 290 C15H14O6 Catequina 12 7,94 865,1984 867,2135 866 C45H38O18 Trímero de procianidina tipo B (isómeto 1) 13 8,57 577,1350 579,1498 578 C30H26O12 Dímero de procianidina tipo B (isómero 4) 14 9,38 289,0715 291,0863 290 C15H14O6 Epicatequina 15 9,75 865,1975 867,2135 866 C45H38O18 Trímero de procianidina tipo B (isómero 2) 16 10,12 787,2662 [M+FA-H] 742 C34H46O18 Siringaresinol diglucósido 17 10,71 609,1457 611,1604 610 C27H30O16 Quercetina-3-O-rutinósido 18 10,89 449,1086 450 C21H22O11 Hexósido de eriodictiol (isómero 1) 19 11,06 463,0881 464 C21H20O12 Quercetin hexósido 20 11,22 593,1512 595,1664 594 C27H30O15 Kaempferol-3-O-rutinósido 21 11,5 579,2084 580 C28H36O13 Siringaresinol 4'-glucósido 22 11,76 433,1138 434 C21H22O10 Naringenina-7-O-glucósido 23 11,85 449,1089 450 C21H22O11 Hexósido de eriodictiol (isómero 2) 24 11,87 354,1335 354 C20H20NO5 Protopina 25 11,96 435,1292 436 C21H24O10 Floretina-2'-O-hexósido 26 12,23 805,2920 806 C39H50O18 Budlenol D 4-O-glucopiranósido 27 12,27 370,1650 369 C21H24NO5 Alocriptopina 28 12,47 338,1388 337 C20H19NO4 Dihidroberberina 29 13,27 352,1544 351 C21H22NO4 Palmatina 30 13,39 336,1230 335 C20H18NO4 Berberina 31 13,79 643,2401 644 C33H40O13 Budlenol D 32 14,13 271,0611 273,0757 272 C15H12O5 Naringenina 33 16,74 293,1758 294 C17H26O4 6-Gingerol 34 18,54 559,3123 514 C27H46O9 Hexósido del ácido 9,12,15- octadecatrienoico * Los valores de MS-ESI- y MS-ESI+ corresponden a los aductos [M-H]- y [M+H]+, respectivamente. 30 Tabla 2. Determinación de compuestos químicos de los frutos de Lepidoceras peruvianum Kuijt mediante LC-MS/MS. Ayacucho 2024. N° tR (min) MS-ESI- MS-ESI+ Masa nominal Fórmula molecular Estructura tentativa 1 175,1191 174 C6H14N4O2 Arginina 2 1,71 181,0708 182 C6H14O6 Manitol 3 1,75 195,0502 196 C6H12O7 Ácido glucónico 4 1,78 135,0288 136 C4H8O5 Ácido treónico 5 1,89 175,0239 176 C6H8O6 Ácido ascórbico 6 1,95 133,0132 134 C4H6O5 Ácido málico 7 2,03 268,1039 267 C10H13N5O4 Adenosina 8 2,2 593,1514 595,1658 594 C27H31O15 Cianidina-3-O-rutinósido (isómero 1) 9 6 577,1346 579,1496 578 C30H26O12 Dímero de procianidina tipo B 10 6,8 289,0715 291,0864 290 C15H14O6 Catequina 11 7,6 447,1504 595,1658 594 C27H31O15 Cianidina-3-O-rutinósido (isómero 2) 12 8,97 289,0717 291,0865 290 C15H14O6 Epicatequina 13 10,42 609,1459 611,1604 610 C27H30O16 Quercetina-3-O-rutinosido 14 10,76 463,0883 464 C21H20O12 Isoquercitina 15 10,96 593,1516 594 C27H30O15 Kaempferol-3-O-hexosil-3''- desoxihexósido 16 11,95 303,0511 304 C15H12O7 Taxifolina 17 11,23 579,2087 580 C28H36O13 Siringaresinol 4'-glucósido 18 13,9 327,2177 328 C18H32O5 Ácido 9,12,13-trihidroxi-10,15- octadecadienoico 19 14,08 271,0612 272 C15H12O5 Naringenina 20 14,4 329,2334 330 C18H34O5 Ácido 9,12,13-Trihidroxi-10- octadecenoico 21 16,49 293,1758 294 C17H26O4 6-Gingerol 22 18,34 559,3123 514 C27H46O9 Hexósido del ácido 9,12,15- octadecatrienoico 23 18,63 452,2780 453 C21H44NO7P 1-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-3- fosfoetanolamina * Los valores de MS-ESI- y MS-ESI+ corresponden a los aductos [M-H]- y [M+H]+, respectivamente. 31 Tabla 3. Contenido de compuestos fenólicos en las hojas y frutos de Lepidoceras peruvianum Kuijt. Ayacucho 2024. Fenoles totales (mgGAE/g) Flavonoides (mgRUE/g) Antocianinas mg/ 100 g Hojas Frutos Hojas Frutos 292,4 ± 2,1* 216,8 ± 3,9* 44,0 ± 1,1 120,08 ± 3,6 mgGAE/g: miligramos equivalentes a ácido gálico por gramo de extracto; mgRUE/g: miligramos equivalentes a rutina por gramos de extracto; mg/100 g: miligramos de antocianinas expresados como cianidina-3-glicósido por 100 g de extracto. *Prueba de T de Student de dos colas para un 95,0 % de nivel de confianza. 32 Tabla 4. Actividad antioxidante in vitro de las hojas y frutos de Lepidoceras peruvianum Kuijt. Ayacucho 2024. Potencial antioxidante Método Parámetro Hojas Frutos Trolox %AA 46,3 ± 0,9 8,5 ± 0,2* 94,8 ± 0,4* DPPH CE50 (µg/mL) 90,6 ± 0,1 624,9 ± 4,6* 36,6 ± 0,4* %AA 58,9 ± 1,9 37,7 ± 2,8* 84,0 ± 1,9* ABTS CE50 (µg/mL) 215,1 ± 0,1 346,8 ± 8,7* 148,1 ± 0,9* %AA 71,2 ± 0,4 61,2 ± 0,4* 90,2 ± 0,1* FRAP CE50 (µg/mL) 101,2 ± 3,9 163,5 ± 8,2* 27,2 ± 1,1* %AA: porcentaje de actividad antioxidante, para DPPH la comparación se realizó a 100 µg/mL; para ABTS y FRAP la comparación se realizó a 250 µg/mL; CE: concentración eficiente antioxidante. * Comparaciones múltiples de Tukey al 95 % de nivel de confianza. 33 V. DISCUSIÓN Lepidoceras peruvianum Kuijt es una especie hemiparásita endémica del Perú. A decir de Kuijt,1 es una especie notable, conocida solo por la colección de tipos en Perú y con la finalidad de revalorar esta especie vegetal, se planteó como objetivo determinar la composición química, el contenido de compuestos fenólicos y potencial actividad antioxidante in vitro de las hojas y frutos de Lepidoceras peruvianum Kuijt. Como primer objetivo específico se planteó determinar la composición química de las hojas y frutos de Lepidoceras peruvianum Kuijt. mediante LC-MS/MS. Los análisis fueron realizados en modo positivo y en modo negativo. En las Figuras 9 y 10 se muestran los cromatogramas de corriente iónica total (TIC) de las hojas y frutos, respectivamente. Estos cromatogramas muestran en el eje “x” el tiempo de retención y la relación masa /carga de la molécula y en el eje “y” la intensidad de las señales (picos). Asimismo, nos informan de la presencia o ausencia de los diferentes compuestos que depende de la abundancia de las moléculas y de sus características estructurales. En las Tablas 1 y 2 se muestra la relación de compuestos detectados en las hojas y frutos de Lepidoceras peruvianum Kuijt. Las tablas incluyen información sobre las estructuras, los valores m/z de los iones detectados en full ESI-MS (positivo y/o negativo) y los principales fragmentos observados en los espectros MS/MS bajo las condiciones experimentales descritas en párrafos anteriores, también se indica el error en ppm para el cálculo de la fórmula molecular (≤ 5 ppm). La identificación de los compuestos presentes en las hojas y frutos de Lepidoceras peruvianum se realizó a partir del análisis por LC-MS/MS en modo negativo y positivo. El cromatograma representado en las Figuras 9 y 10 muestran el perfil químico de las hojas y frutos. Se logró proponer la identificación de 34 compuestos en las hojas (Tabla 1) y 23 compuestos en los frutos (Tabla 2), a través de la masa de iones moleculares en alta resolución, error (ppm) y análisis del perfil de 34 fragmentación de los compuestos (Anexos 4 y 5), comparándolos con librerías del NIST y del MassBank. En la muestra de hojas se detectaron diversos tipos de compuestos (Tabla 1), tales como, ácidos orgánicos, catequinas, procianidinas, lignanos, flavonoides, alcaloides y lípidos. Los alcaloides detectados merecen una exploración más profunda con la finalidad de corroborar las estructuras mediante estudio espectroscópicos de RMN, ello debido a la ausencia de registro de estudios químicos del género Lepidoceras, lo cual puede también abrir a la puerta al hallazgo de nuevas estructuras. Respecto a la composición química de las hojas (Tabla 1), en los primeros 2,19 minutos del cromatograma se lograron identificar metabolitos primarios, en modo negativo, tales como, carbohidratos [2, 3], ácidos orgánicos [5, 7], corresponden al manitol, sacarosa, ácido málico y citrato, En modo positivo se identificaron aminoácidos [1] y nucleósidos [6] que corresponden a la arginina y la adenosina respectivamente; además se identificó en modo negativo al glutatión [4] (Figura 9 y Tabla 1). Entre 3,57 y 9,75 minutos, se identificaron flavonoles [11, 14] tanto en modo negativo y modo positivo, que corresponden a la catequina y la epicatequina, respectivamente; asimismo, se identificaron taninos condensados [8, 9, 11, 13,] que corresponden a los dímeros de procianidinas y sus isómeros 1, 2, 3 y 4, respectivamente y los taninos condensados [12, 15] que corresponden a los trímeros de procianidinas y sus isómeros 1 y 2 respectivamente (Figura 9 y Tabla 1), A partir de los 10,12 hasta los 12,23 minutos, en modo negativo se identificaron lignanos siringaresinol diglucósido [16] y 4´-siringaresinol diglucósido [21]; asimismo, se identificaron flavonoides y sus glucósidos que corresponde quercetina hexósido [19] y naringenina-7-O-glucósido [22] y en modo negativo y positivo la quercetina-3-O-rutinósido [17] y el kaempferol-3-O-rutinósido [20], Otros compuestos identificados en modo negativo tenemos a otros glucósidos como el hexósido de eriodictiol (isómero 1) [18], hexósido de eriodictiol (isómero 2) [23], floretina-2'-O-hexósido [25], budlenol D 4-O-glucopiranósido [26]; además de un alcaloide la protropina [24] (Figura 9 y Tabla 1). De los 12,27 a 13,39 minutos se identificaron en modo positivo un grupo de alcaloides, entre ello, la alocriptopina [27], dihidroberberina [28], palmatina [29] y berberina [30] (Figura 9 y Tabla 1). 35 A través de la propuesta de identificación se pudo confirmar la presencia de flavonoides, compuestos fenólicos y derivados que fueron evidenciados en el tamizaje fitoquímico realizado por Aronés et al3; sin embargo, se evidencia presencia importante de alcaloides, que no fue reportardo por el autor. En la Tabla 3, se presentan los resultados de la cuantificación de fenoles totales (TPC), obtenidos mediante el método Folin-Ciocalteau y expresados en miligramos equivalentes a ácido gálico por gramo de extracto (mg GAE/g). Se evidencia que las hojas de la planta contienen un contenido de fenoles totales (TPC) de 292,4 ± 2,1 mg GAE/g, los cuales fueron estadísticamente superiores a los obtenidos para el fruto (p < 0,05) que presentó 216,8 ± 3,9 mg GAE/g. Estos resultados concuerdan con lo reportado por Aronés et al.3 Sin embargo, es importante destacar que estos valores son inferiores en comparación con los reportados en otras investigaciones. Por ejemplo, Sousa et al.,27 determinaron el contenido de fenoles totales en cinco plantas medicinales, registrando valores de TPC de hasta 763,63 ± 2,5 mg GAE/g. En relación con el contenido de flavonoides (TFC), que fueron expresados como miligramos equivalentes a rutina por gramo de extracto (mg RUE/g), las hojas mostraron un valor de 44,0 ± 1,1 mg RUE/g. Este valor es igualmente inferior a lo encontrado en diferentes extractos, como en el caso de M. communis, donde se reportaron valores de TFC que variaron desde 77,30 ± 0,8 hasta 129,96 ± 2,29 mg RUE/g.28 De los compuestos químicos identificados en las hojas de Lepidoceras peruvianum (Tabla 1) podemos evidenciar compuestos que tiene una demostrada acitvidad antioxidante. La capacidad antioxidante de un compuesto químico se refiere a su habilidad para neutralizar radicales libres y otros compuestos reactivos de oxígeno, lo que puede ayudar a prevenir el daño celular y tiene implicaciones importantes para la salud. Estas propiedades antioxidantes, se deben principalmente debido a su estructura química que permite la donación de electrones para neutralizar radicales libres.29 Entre estos compuestos tenemos al glutatión, que es un antioxidante muy potente presente en las células, que juega un papel crucial en la protección contra el estrés oxidativo.30 La catequina y epicatequina son tipos de flavonoides encontrados en el té verde y otros alimentos, conocidos por sus fuertes propiedades antioxidantes.31 La quercetina- 3-O-rutinósido, quercetina hexósido y kaempferol-3-O-rutinósido son flavonoides conocidos por sus efectos antioxidantes, ayudando a proteger las células contra el daño de los radicales libres.32 Los dímeros y trímeros de procianidina tipo B que 36 son compuestos que también pertenecen a la clase de los flavonoides, han demostrado tener propiedades antioxidantes significativas.33 El siringaresinol diglucósido y siringaresinol 4'-glucosido son lignanos que pueden actuar como antioxidantes.34 La naringenina y naringenina-7-O-glucósido son flavanones con propiedades antioxidantes conocidas.35 Los hexósidos de eriodictiol son flavanones que también exhiben actividad antioxidante.36 Entre los compuestos identificados en las hojas, de manera particular, se evidencia la presencia del alcaloide berberina. Este compuesto tiene especial interés debibo a que Lepidoceras peruvianum Kuijt es una plnata hemiparásita que tiene como hospedero a por lo menos tres especies vegetales, pero mayoritariamente se ha evidenciado como hospedero a Berberis flexuosa. Si bien es cierto, no hay reportes de la composición química de Berberis flexuosa, existen reportes diversos estudios sobre la presencia de berberina en hojas de diferentes especies del género berberis, tales como, en Berberis vulgaris.7 Además, de la observación macroscópica de sus órganos vegetativos se puede observar cierto parecido entre ambas especies, por ejemplo, en las formas de las hojas y frutos. Con la identificación de berberina en las hojas se puede hipotetizar que podría existir una transferencia de material genético entre el Berberis flexuosa (hospedero) y Lepidoceras peruvianum (hemiparásita). Al respecto, la transferencia de material genético entre dos especies vegetales, incluyendo un hospedero y su respectiva hemiparásita, es un fenómeno conocido como transferencia horizontal de genes (THG). La THG es un proceso mediante el cual el ADN se transfiere de un organismo a otro que no es su descendiente directo. Este proceso ha sido bien documentado en bacterias, pero también ocurre en plantas, aunque con menos frecuencia.37 Esta hipótesis se refuerza con los hallazgos de Adler et al.,38 quienes describieron un interesante fenómeno biológico en el que dos especies hemiparásitas, Castilleja miniata y Castilleja indivisa, desarrollaron una estrategia para reducir la herbivoría, es decir, el consumo por parte de herbívoros. Esta estrategia consiste en obtener alcaloides de las plantas huéspedes Lupinus argenteus y Lupinus texensis, respectivamente, ambas pertenecientes a la familia Fabaceae. Las plantas hemiparásitas, que obtienen nutrientes de otras plantas mediante haustorios sin matarlas, podrían intercambiar material genético con sus hospedadores. Este intercambio podría afectar significativamente las propiedades químicas de ambas plantas, introduciendo genes que permiten la producción de 37 nuevos compuestos o la modificación de los existentes, alterando vías metabólicas y la regulación genética, y cambiando la expresión de genes nativos. Estos cambios podrían mejorar la adaptación mutua y optimizar la interacción entre la planta hemiparásita y su hospedero mediante ajustes en la producción de compuestos químicos.39,40 Sin embargo, la evidencia directa de la transferencia horizontal de genes influenciando la composición química en plantas hemiparásitas y sus hospederos es limitada y es un área de investigación activa. La detección de tales eventos requiere enfoques genómicos y metabolómicos detallados para identificar y caracterizar cualquier transferencia de genes y sus efectos funcionales.40 En la muestra de frutos se identificaron ácidos orgánicos, catequinas, procianidinas, antocianinas, flavonoides, lignanos y lípidos. Varios de los compuestos detectados también están presentes en las hojas, excepto por las antocianinas (Tabla 2). Los resultados del análisis LC-MS de frutos de Lepidoceras peruvianum (Figura 9 y Tabla 2) revela una amplia gama de compuestos. Se evidencia que hasta los 2,03 minutos se identificó el aminoácido arginina [1] en el modo positivo; asimismo, se identificó en el modo negativo al manitol [2] y ácidos orgánicos, tales como, ácido glucónico [3], ácido treónico [4], ácido ascórbico [5], ácido málico [6]; además de la adenosina [7]. De los 2,2 a 8,97 minutos se identificaron, tanto en el modo negativo y positivo, al dímero de procianidina tipo B [9] (tanino condensado), antocianinas [8, 11] que corresponden a cianidina-3-O-rutinósido isómero 1 y 2, respectivamente. Se identificaron flavonoles [10, 12] que corresponden a catequina y epicatequina, respectivamente. También se identificó la quercetina-3- O-rutinósido [13]. En el modo negativo se identificaron los flavonoides isoquercitina [14] y kaempferol-3-O-hexosil-3''-desoxihexósido [15]. Entre los 11,23 a 11,95 minutos, en el modo negativo se identificaron el flavonoide taxifolina [16] y lignano siringaresinol 4ʹ-glucósido [17]. Finalmente, a partir de los 12,02 minutos en modo negativo de identificaron los ácidos grasos ácido 9,12,13- trihidroxi-10,15-octadecadienoico [18] y Ácido 9,12,13-Trihidroxi-10- octadecenoico [20]; el flavonoide naringenina [19], el 8-gingerol [21], el glucolípido hexósido del ácido 9,12,15-octadecatrienoico [22] y el fosfolípido 1-palmitoil-2- hidroxi-glicero-3-fosfoetanolamina [23]. Estos resultados sugieren que los frutos de Lepidoceras peruvianum poseen una compleja mezcla de compuestos con potencial antioxidante, antiinflamatorio y 38 beneficios para la salud en general. La presencia de estos compuestos subraya la importancia de esta planta en dietas y posiblemente en aplicaciones farmacológicas, sujetas a futuras investigaciones. Comparativamente, del Carpio et al.,24 identificaron las antocianinas presentes en Berberis boliviana Lechler, entre ellas, delfinidina-3-glucósido, delfinidina-3- rutinósido, cianidina-3-glucósido, cianidina-3-rutinósido, petunidina-3-glucósido, petunidina-3-rutinósido, peonidina-3-glucósido, peonidina-3-rutinósido, malvidina- 3-glucósido y malvidina-3-rutinósido. También, se ha reportado, en frutos de Berberis vulgaris, la presencia de dextrosa, levulosa, ácidos cítrico, tartárico y málico, goma, pectosa y en las semillas se pueden encontrar trazas de alcaloides.7 En lo que respecta a los frutos de la planta estudiada, se determinó que poseen un contenido de antocianinas de 120,08 ± 3,6 mg por cada 100 gramos, valor expresado en equivalencia a cianidina-3-glicósido. Este resultado se encuentra por debajo del contenido de antocianinas observado en frutos de otras especies. Por ejemplo, en el caso de Berberis boliviana se reportó un contenido de antocianinas de 1500 mg/100 g de fruto seco. De manera similar, en V. myrtillus (arándano) se encontraron valores que oscilan entre 300 y 320 mg/100 g, mientras que en Sambucus nigra (saúco) se registró un contenido de 450 mg/100 g.24 Otro de los objetivos de esta investigación fue evaluar el potencial antioxidante de las hojas y frutos de Lepidoceras peruvianum Kuijt (Tabla 4) por tres métodos in vitro (DPPH, ABTS y FRAP). La actividad antioxidante se cuantificó y expresó como el porcentaje de Actividad Antioxidante (%AA). Este valor se calculó específicamente a una concentración estandarizada de 100 microgramos por mililitro (100 µg/mL). De esta forma, el %AA proporciona es una medida directa de la eficacia antioxidante del extracto a una concentración dada, facilitando la comparación y evaluación de su potencial antioxidante. Asimismo, la actividad antioxidante de la muestra también se evaluó y expresó en términos de la Concentración Eficiente Antioxidante (CE50), medida en microgramos por mililitro (µg/mL). Este parámetro CE50 refleja la concentración necesaria para alcanzar el 50% de la actividad antioxidante máxima. Cabe destacar que una menor valoración de CE50 indica una mayor potencia antioxidante, ya que se requiere una menor concentración del extracto para ejercer el 50% de su capacidad antioxidante máxima. Para evaluar la eficacia antioxidante del extracto, los valores obtenidos tanto del porcentaje de Actividad Antioxidante (%AA) como de la Concentración Eficiente 39 Antioxidante (CE50) fueron comparados con los valores obtenidos utilizando Trolox como estándar de referencia. Esta comparación se realizó mediante la prueba de Comparaciones Múltiples de Tukey, aplicando un nivel de significancia estadística de p < 0,05. Este análisis permitió determinar si existían diferencias significativas entre la actividad antioxidante del extracto y la del Trolox, un antioxidante conocido por su eficacia. Utilizando el método DPPH se encontró que las hojas de la planta exhibieron un valor significativamente mayor de actividad antioxidante, con un 46,3 ± 0,9 %, en comparación con los frutos (p < 0,05); sin embargo, este valor fue estadísticamente menor en comparación con el Trolox, el cual demostró una actividad antioxidante de 94,8 ± 0,4 % (p < 0,05). En términos de la Concentración Eficiente Antioxidante (CE50), las hojas mostraron un valor de 90,6 ± 0,1 µg/mL, aunque este valor fue superior al obtenido por el Trolox (p < 0,05), es importante recordar que una menor CE50 indica una mayor actividad antioxidante, por lo que los resultados sugieren que el Trolox posee una capacidad antioxidante superior en comparación con las hojas. Mediante la aplicación del método ABTS●+ para la medición de la actividad antioxidante, se observó que las hojas de la planta también mostraron una actividad antioxidante significativamente más alta, alcanzando un 58,9 ± 1,9 %, en comparación con los frutos, con una diferencia estadísticamente significativa (p < 0,05). No obstante, al comparar este valor con el Trolox, se encontró que las hojas tenían una actividad antioxidante estadísticamente inferior, ya que el Trolox registró un valor de 84,0 ± 1,9 % (p < 0,05). Respecto a la Concentración Eficiente Antioxidante (CE50), las hojas presentaron un valor de 215,1 ± 0,1 µg/mL; aunque este valor fue más alto que el obtenido para el Trolox, sugiriendo que el Trolox posee una mayor eficacia antioxidante en comparación con las hojas de la planta bajo estudio. Utilizando el método FRAP para la evaluación de la actividad antioxidante, se descubrió que las hojas de la planta mostraron una actividad antioxidante significativamente superior, alcanzando un 71,2 ± 0,4 %, en comparación con los frutos. Esta diferencia fue estadísticamente significativa (p < 0,05), indicando una mayor capacidad antioxidante en las hojas. Sin embargo, al comparar este resultado con el Trolox, se observó que la actividad antioxidante de las hojas era estadísticamente inferior, ya que el Trolox alcanzó un valor de 90,2 ± 0,1 % (p < 0,05). En cuanto a la Concentración Eficiente Antioxidante (CE50), las hojas 40 presentaron un valor de 101,2 ± 3,9 µg/mL; a pesar de que este valor fue más elevado que el obtenido para el Trolox, sugiere que el Trolox exhibe una mayor eficacia antioxidante. Se observó que existe una correlación directa entre la actividad antioxidante in vitro y el contenido total de polifenoles (TPC, por sus siglas en inglés) en ambas hojas y frutos de la planta estudiada. Esta correlación indica que a mayor concentración de TPC, se registra un incremento en la actividad antioxidante. Este hallazgo subraya la importancia de los compuestos fenólicos en la contribución a la capacidad antioxidante del extracto, tanto en las hojas como en los frutos de la planta. Los resultados de la evaluación del potencial antioxidante son congruentes con lo reportado por Aronés et al.3 Los resultados de este estudio demuestran que las hojas de Lepidoceras peruvianum presentan un contenido notable de fenoles totales (TPC) y una actividad antioxidante apreciables. Esta especie hemiparásita y endémica se encuentra en las zonas altoandinas del distrito de Vinchos, en Perú. Fue recolectada y clasificada por primera vez por el botánico Weberbauer,2 en 1910 y posteriormente revisada por Kuijt en 1988. La singularidad de Lepidoceras peruvianum como especie endémica de la región de Ayacucho, Perú, resalta su importancia en la preservación del contenido genético único de esta especie. Esto contrasta con Lepidoceras chilensis,1 que se encuentra exclusivamente en Chile, subrayando la relevancia de Lepidoceras peruvianum no solo por sus propiedades fitoquímicas sino también por su valor en la conservación de la biodiversidad regional. 41 VI. CONCLUSIONES 1. El análisis LC-MS/MS de las hojas de Lepidoceras peruvianum Kuijt, reportó la presencia de carbohidratos, ácidos orgánicos, aminoácidos, nucleósidos, flavonoides, taninos condensados, lignanos, alcaloides, entre otros compuestos químicos. 3. El análisis LC-MS/MS de los frutos de Lepidoceras peruvianum Kuijt, reportó la presencia de aminoácidos, ácidos orgánicos, nucleósidos, taninos condensados, antocianinas, flavonoides, entre otros compuestos. 4. Las hojas y frutos de Lepidoceras peruvianum Kuijt. contienen compuestos fenólicos que le confieren un potencial antioxidante in vitro, evidenciado por los resultados obtenidos a través de los métodos DPPH, ABTS•+ y FRAP. 43 VII. RECOMENDACIONES 1. Se recomienda realizar investigaciones que permitan determinar la transferencia genética horizontal entre Berberis flexuosa y Lepidoceras peruvianum. 2. Se recomienda proseguir con la evaluación de la actividad antioxidante con otros ensayos in vitro y ensayos in vivo que permitan confirmar el potencial antioxidante de Lepidoceras peruvianum. 3. Se recomienda indagar a profundidad el perfill de antocianinas en los frutos de Lepidoceras peruvianum. 4. Se recomienda realizar ensayos in silicio con los resultados del perfil químico de las hojas y frutos de Lepidoceras peruvianum. 5. Se recomienda realizar estudios para el aislamiento e identificaicón de alcaloides por resonancia magnética nuclear. 45 VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Kuijt J. Monograph of the Eremolepidaceae. Systematic Botany Monographs 1988; 18: 1–60, http://www.jstor.org/stable/25027689 (1988). 2. León B. Eremolepidaceae endémicas del Perú. Revista Peruana de Biología 2006; 13: 284s. 3. Aronés Jara MR, Cárdenas Landeo E, Luna Molero HR, et al. Tamizaje fitoquímico, contenido de compuestos fenólicos y potencial antioxidante de trece plantas medicinales de los afloramientos rocosos del Bosque de Piedras de Huaraca en Perú. rsqp 2023; 88. 4. Press MC and Phoenix GK. Impacts of parasitic plants on natural communities. New Phytologist 2005; 166: 737–751. 5. Twyford AD. Parasitic plants. Curr Biol 2018; 28: R857-R859. 6. 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Identificación taxonómica de Lepidoceras peruvianum Kuijt. Ayacucho 2024. 52 Anexo 2. Ubicación del Bosque de Piedras de Huaraca en el Centro Poblado de Huaraca en el distrito de Vinchos, provincia de Huamanga, Departamento de Ayacucho. Ayacucho 2024. 53 Anexo 3. Matriz de definición y operacionalización de variables. Ayacucho 2024. Variables Definición conceptual Definición operacional Perfil químico Es la composición química cuali cuantitativa de los aceites esenciales. Es la señal que reporta el detector de masas luego de la cromatografía líquida acoplada a detector de masas, en el cual cada señal está dada por el tiempo de retención y masa monoisotópica, que corresponde a un compuesto químico. Compuestos fenólicos Los compuestos fenólicos son una clase de compuestos orgánicos que contienen un anillo fenólico, es decir, un anillo aromático con al menos un grupo hidroxilo (-OH) unido a él. Se mide por el contenido de fenoles totales (TPC), el contenido de flavonoides (TFC) y de antocianinas (TAC). Actividad antioxidante Capacidad de inhibir la acción de los radicales libres. Se mide por la capacidad de inhibir el radical libre DPPH, ABTS y FRAP. 54 Anexo 4. Determinación de compuestos químicos de las hojas de Lepidoceras peruvianum Kuijt mediante LC-MS/MS. Ayacucho 2024. N° tR (min) MS-ESI- MS2 MS-ESI+ MS2 Masa nominal Fórmula molecular Estructura tentativa 60,0564 70,0658 1 1,64 175,1191 112,0872 174 C6H14N4O2 Arginina 116,0709 130,0975 158,0924 163,0604 131,0341 119,034 2 1,8 181,0712 101,0234 182 C6H14O6 Manitol 89,0233 85,0284 71,0227 59,0127 179,0555 161,0447 143,0341 119,034 3 1,81 341,1089 113,0235 342 C12H22O11 Sucrosa 101,0234 89,0233 71,0127 59,0128 291,0644 245,0591 233,059 179,0484 4 2,05 308,0911 162,0219 307 C10H17N3O6S Glutathione 144,0114 130,05 116,0168 84,0449 76,0222 115,0027 5 2,07 133,0134 89,0233 134 C4H6O5 Ácido málico 72,992 71,0127 136,0619 115,0392 6 2,14 268,1042 85,0289 267 C10H13N5O4 Adenosina 73,0291 57,0342 173,0085 129,0182 7 2,19 133,0134 111,0078 134 C6H8O7 Citrato 87,0077 85,0284 407,0771 427,1026 339,0874 409,0917 289,0716 301,0705 245,0816 287,0549 Dímero de procianidina tipo B (isómero 1) 8 3,57 577,1357 205,0502 579,1501 275,0549 578 C30H26O12 161,0236 259,0603 125,0235 247,0602 191,034 163,039 55 Anexo 4. Cont. N° tR (min) MS-ESI- MS2 MS-ESI+ MS2 Masa nominal Fórmula molecular Estructura tentativa 407,0769 427,1023 339,0876 409,0916 289,0716 301,0705 245,0815 287,0549 205,0502 275,0548 Dímero de 9 5,69 577,1354 175,0391 579,1501 259,06 578 C H O procianidina 161,0236 247,0601 137,0235 233,0444 125,0235 191,0338 163,039 139,039 127,0391 30 26 12 tipo B (isómero 2) 407,0769 427,1021 339,0869 409,0916 289,0715 301,0706 245,0815 287,0548 203,0705 275,0547 Dímero de 10 6,9 577,135 179,034 579,1496 259,06 578 C H O procianidina 161,0235 247,06 137,0235 233,0444 125,0234 191,0338 163,0389 139,039 127,0391 30 26 12 tipo B (isómero 3) 245,0815 273,0756 221,0813 249,0761 203,0706 207,0652 187,0397 165,0547 11 7,6 289,0717 179,0393 291,0862 147,044 290 C15H14O6 Catequina 161,06 139,039 151,0392 123,0443 137,0235 125,0234 109,0284 525,0712 697,154 12 7,94 865,1984 407,0771 579,149 289,0714 437,0866 243,0295 407,076 217,0503 397,0916 161,0236 867,2135 289,0706 125,0234 275,0548 245,0444 163,0389 139,039 127,0391 866 C45H38O18 B-type procyanidin trimer (isomer 1) 407,0767 427,1023 339,0871 409,0915 289,0714 301,0706 245,0815 291,0862 203,0708 271,0599 Dímero de 13 8,57 577,135 179,034 579,1498 259,0601 578 C H O procianidina 161,0235 247,0601 30 26 12 tipo B 137,0234 233,0444 (isómero 4) 125,0234 191,034 163,0389 139,039 127,0391 56 Anexo 4. Cont. N° tR (min) MS-ESI- MS2 MS-ESI+ MS2 Masa nominal Fórmula molecular Estructura tentativa 245,0814 273,0755 221,0814 249,0755 203,0706 207,0651 187,0392 165,0546 14 9,38 289,0715 179,0341 291,0863 147,044 290 C H O Epicatequina 165,0184 139,039 151,0391 123,0443 137,0233 125,0233 109,0284 15 14 6 525,0814 297,1546 15 9,75 865,1975 407,0766 579,1491 289,0713 437,0866 243,0294 427,1022 217,0497 407,0759 175,0392 867,2135 289,0706 161,0235 271,0601 125,0234 247,0601 163,039 139,039 127,0391 866 C45H38O18 Trímero de procianidina tipo B (isómero 1) 16 10,12 787,2662 [M+FA-H] 417,1552 402,131 387,108 181,0499 166,0267 96,4146 300,0273 465,1023 742 C34H46O18 Siringaresinol diglucosido 17 10,71 609,1457 271,0244 303,0498 255,0295 611,1604 129,0547 610 C27H30O16 Quercetina-3- 18 10,89 449,1086 178,9978 85,0289 151,0028 71,0498 287,0558 193,0136 175,0029 450 C21H22O11 O-rutinosido Hexósido de eriodictiol 151,0028 (isómero 1) 135,0442 125,0231 300,0272 271,0244 19 11,06 463,0881 255,0296 464 C21H20O12 Quercetin hexoside 178,998 151,0027 327,0504 449,109 285,0399 287,055 255,0296 129,0547 Kaempferol- 20 11,22 593,1512 229,0506 595,1664 85,0289 594 C27H30O15 3-O- 227,0342 71,0498 rutinosido 178,9976 151,0029 417,155 402,1311 21 11,5 579,2084 387,1082 580 C28H36O13 Siringaresinol 4'-glucosido 181,0498 166,0263 57 21 22 10 Anexo 4. Cont. N° tR (min) MS-ESI- MS2 MS-ESI+ MS2 Masa nominal Fórmula molecular Estructura tentativa 22 11,76 433,1138 313,0715 271,0609 177,0186 151,0027 145,0285 119,0492 93,0334 329,0506 287,0555 259,0616 434 C H O Naringenina-7- O-glucosido Hexósido de 23 11,85 449,1089 181,0135 166,9977 151,0027 135,0441 336,1227 275,0699 247,0752 450 C21H22O11 eriodictiol (isómero 2) 24 11,87 354,1335 206,0811 354 C H NO Protopina 25 11,96 435,1292 273,0765 229,0865 179,0341 167,0341 125,0233 189,0783 188,0706 165,0546 149,0597 20 20 5 436 C21H24O10 Floretina-2'-O- hexósido 123,044 119,0493 93,0334 595,2179 580,1922 565,1799 550,1837 417,155 402,131 Buddlenol D 4- 26 12,23 805,292 387,1503 806 C39H50O18 O- 359,1128 glucopiranosido 225,0762 210,0526 195,0655 181,0497 166,0263 58 Anexo 4. Cont. 290,0937 21 24 5 29 13,27 352,1544 30 13,39 336,123 595,2179 580,1944 565,1671 550,1837 294,1123 279,0898 337,1303 336,123 322,1073 308,128 294,1128 321,0993 320,0917 306,0761 304,0966 292,0967 na 351 C21H22NO4 Palmatina 335 C20H18NO4 Berberina 31 13,79 643,2401 417,1557 402,1315 387,1463 359,1144 225,0762 227,0707 171,0289 644 C33H40O13 Buddlenol D 177,0185 153,0183 165,0186 147,0441 32 14,13 271,0611 151,0028 273,0757 123,0442 272 C15H12O5 Naringenina 33 16,74 293,1758 119,0492 119,0494 107,0128 93,03335 236,1049 221,154 207,1387 192,1149 151,0758 127,0758 277,217 253,0926 294 C17H26O4 6-Gingerol Hexósido del 34 18,54 559,3123 161,0446 119,0339 101,0233 89,0232 514 C27H46O9 ácido 9,12,15- octadecatrien oico N° tR (min) MS-ESI- MS2 MS-ESI+ MS2 Masa Fórmula Estructura nominal molecular tentativa 27 12,27 352,1543 337,1543 321,109 370,165 306,0878 369 C H NO Alocriptopina 206,0812 188,0707 181,0859 28 323,1151 322,1074 12,47 338,1388 308,0917 337 C20H19NO4 Dihidroberberi 59 Anexo 5. Determinación de compuestos químicos de los frutos de Lepidoceras peruvianum Kuijt mediante LC-MS/MS. Ayacucho 2024. N° tR (min) MS-ESI- MS2 MS-ESI+ MS2 Masa nominal 60,0564 70,0658 Fórmula molecular Estructura tentativa 1 175,1191 163,06 131,034 119,034 112,087 116,071 130,098 158,092 174 C6H14N4O2 Arginina 6 14 6 4 6 5 9 6 577,1346 161,024 579,1496 259,06 578 C H O Dímero de 2 1,71 181,0708 101,023 89,0232 182 C H O Manitol 85,0282 71,0126 59,0126 177,04 159,029 129,018 3 1,75 195,0502 99,0075 196 C6H12O7 Ácido glucónico 89,0232 75,0075 59,0127 117,018 89,0232 4 1,78 135,0288 75,0075 136 C4H8O5 Ácido treónico 72,9919 59,0127 146,96 115,003 5 1,89 175,0239 87,0075 176 C6H8O6 Ácido ascórbico 71,0126 59,0127 115,003 6 1,95 133,0132 89,0232 72,9919 134 C H O Ácido málico 71,0126 136,062 115,039 7 2,03 268,1039 85,0289 267 C10H13N5O4 Adenosina 73,0291 57,0342 284,032 449,107 Cianidina-3-O- 8 2,2 593,1514 147,008 595,1658 594 C27H31O15 rutinósido 125,023 287,055 (isómero 1) 407,077 427,102 339,087 409,092 289,071 301,071 245,082 287,055 203,071 275,055 137,023 247,06 30 26 12 procianidina tipo B 125,023 233,044 191,034 163,039 139,039 127,039 60 27 31 15 Anexo 5. Cont. N° tR (min) MS-ESI- MS2 MS-ESI+ MS2 Masa nominal Fórmula molecular Estructura tentativa 245,082 273,077 221,081 249,076 203,071 207,065 187,039 165,055 10 6,8 289,0715 179,034 291,0864 147,044 290 C H O Catequina 165,019 139,039 151,039 123,044 137,024 125,023 109,028 15 14 6 11 7,6 447,1504 595,1658 245,082 449,107 287,055 273,076 594 C H O Cianidina-3-O-rutinósido (isómero 2) 221,081 249,076 203,071 207,065 187,039 165,055 12 8,97 289,0717 179,034 291,0865 147,044 290 C H O Epicatequina 165,018 139,039 15 14 6 151,039 123,044 137,023 125,023 109,028 300,028 465,102 271,025 303,05 13 10,42 609,1459 255,029 611,1604 129,055 610 C27H30O16 Quercetina-3-O- rutinosido 178,998 85,0289 151,003 71,0498 300,027 271,025 14 10,76 463,0883 255,03 464 C21H20O12 Isoquercitina 178,998 151,00