FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA Presentado por la: Bach. DE LA CRUZ APARICIO, Lia Carolay Asesor: Dr. TINCO JAYO, Johnny Aldo AYACUCHO - PERÚ 2023 UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTÓBAL DE HUAMANGA Efecto antiespasmódico del extracto hidroalcohólico de hojas y tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra” en íleon aislado de rata, Ayacucho 2022 TESIS PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL DE QUÍMICA FARMACÉUTICA ii A Dios, por guiarme en cada momento de mi vida. A mis padres Alejandrina y Hector por su apoyo incondicional. A mis hermanos Zhintia, Zhiza, Dirse, Kadu y Daira por brindarme momentos de felicidad en mi vida. iii AGRADECIMIENTOS A la Universidad Nacional de San Cristóbal de Huamanga, por brindarme una formación profesional. A la Facultad de Ciencias de la Salud y a la Escuela Profesional de Farmacia y Bioquímica, por acogerme en sus aulas durante 5 años de estudio. A mi asesor Dr. Johnny Aldo Tinco Jayo, por haberme brindado su gran apoyo y ofrecerme su infinita confianza para desarrollar y culminar este tema de investigación. iv ÍNDICE GENERAL ÍNDICE DE TABLAS v ÍNDICE DE FIGURAS vi ÍNDICE DE ANEXOS vii RESUMEN ix I. INTRODUCCIÓN 1 II. MARCO TEÓRICO 3 2.1. Antecedentes 3 2.2. Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra” 8 2.3. Metabolitos secundarios con propiedades antiespasmódicas 11 2.4. Intestino delgado 12 2.4.1. Anatomía y fisiología del intestino delgado. 12 2.4.2. Motilidad gastrointestinal. 13 2.4.3. Neurotransmisión colinérgica del tracto gastrointestinal. 14 2.4.4. Acetilcolina 16 2.4.5. Tratamiento farmacológico. . 17 III. MATERIALES Y METODOS 20 3.1. Lugar de ejecución. 20 3.2. Materiales. 20 3.3. Unidad de experimentación. 20 3.4. Procedimiento metodológico para la recolección de datos. 21 3.4.1. Selección de la muestra vegetal . 21 3.4.2. Elaboración del extracto hidroalcohólico de las hojas y tallos. 21 3.4.3. Tamizaje fitoquímico. 21 3.4.4. Evaluación del efecto antiespasmódico 22 3.5. Análisis de datos 24 IV. RESULTADOS 25 V. DISCUSIÓN 31 VI. CONCLUSIONES 41 VII. RECOMENDACIONES 42 VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .. 43 ANEXOS 49 v ÍNDICE DE TABLAS Página Tabla 1 Organización experimental para evaluar el efecto antiespasmódico en íleon aislado de rata, Ayacucho 2022. 24 Tabla 2 Metabolitos secundarios presentes en el extracto hidroalcohólico de las hojas de Cnidoscolus diacanthus (pax. & hoffm.) Macbr. “huanarpo hembra”, Ayacucho 2022. 26 Tabla 3 Metabolitos secundarios presentes en el extracto hidroalcohólico de los tallos de Cnidoscolus diacanthus (pax. & hoffm.) Macbr. “huanarpo hembra”, Ayacucho 2022. 27 vi ÍNDICE DE FIGURAS Página Figura 1 Estructura básica de flavonoides 11 Figura 2 Estructura básica de taninos 12 Figura 3 Estructura básica del alcaloide 12 Figura 4 Estructura química de la acetilcolina 16 Figura 5 Estructura química de la atropina 18 Figura 6 Estructura química de la hioscina 19 Figura 7 Variación de altura de las contracciones del íleon por efecto de la administración de cloruro sódico 0,9 %, acetilcolina 2x10-1 M, atropina 1x10-4 M, N-Butil bromuro de hioscina 1x10-3 M y las concentraciones de 2mg/ml, 1mg/ml y 0,5mg/ml del extracto hidroalcohólico de tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”, Ayacucho 2022. 28 Figura 8 Variación de altura de las contracciones del íleon por efecto de la administración de cloruro sódico 0,9 %, acetilcolina 2x10-1 M, atropina 1x10-4 M, N-Butil bromuro de hioscina 1x10-3 M y las concentraciones de 2mg/ml, 1mg/ml y 0,5mg/ml del extracto hidroalcohólico de hojas de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”, Ayacucho 2022. 29 Figura 9 Porcentaje de inhibicion contráctil por efecto de la atropina 1x10-4 M, N-Butil bromuro de hioscina 1x10-3 M y las concentraciones de 2mg/ml, 1mg/ml y 0,5mg/ml del extracto hidroalcohólico de las hojas y tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra” en íleon aislado de rata. Ayacucho 2022. 30 vii ÍNDICE DE ANEXOS Página Anexo 1 Constancia de clasificación taxonómica de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”. 50 Anexo 2 Constancia sanitaria de los animales en experimentación. 51 Anexo 3 Flujograma de obtención del extracto hidroalcohólico de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”, Ayacucho 2022. 52 Anexo 4 Evaluación farmacológica del extracto hidroalcohólico de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”. 53 Anexo 5 Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”. 54 Anexo 6 Proceso de extracción hidroalcohólica de las hojas y tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”, Ayacucho 2022. 55 Anexo 7 Tamizaje fitoquímico del extracto hidroalcohólico de las hojas de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”. 56 Anexo 8 Tamizaje fitoquímico del extracto hidroalcohólico de los tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”. 57 Anexo 9 Solución Tyrode – Medio nutricio, composición. 58 Anexo 10 Quimógrafo Panlab Harvard (baño automático de órganos aislados), equipo ubicado en el laboratorio de farmacología de la facultad de farmacia y bioquímica, Ayacucho 2022 59 Anexo 11 Procedimiento experimental para determinar el efecto antiespasmódico en el íleon aislado de rata. Realizado en el laboratorio de farmacología de la facultad de farmacia y bioquímica, Ayacucho 2022. 60 Anexo 12 Respuesta del íleon aislado de rata, tras la inyección de acetilcolina 2x10-1 M en el baño de órganos aislados, registrados por el Software LabChart, Ayacucho 2022. 61 Anexo 13 Respuesta de inhibición contráctil tras la inyección de atropina 1x10- 4 M y N-Butilbromuro de hioscina 1x10-3 M en íleon aislado de rata, Ayacucho 2022. 62 viii Anexo 14 Respuesta de inhibición contráctil tras la inyección de 2 mg/ml del extracto hidroalcohólico de las hojas y tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”, Ayacucho 2022. 63 Anexo 15 Análisis de varianza (ANOVA) de altura de las contracciones del íleon por efecto de la acetilcolina 2x10-1 M, atropina 1x10-4 M, N- Butilbromuro de hioscina 1x10-3 M y las concentraciones de 2mg/ml, 1mg/ml y 0,5mg/ml del extracto hidroalcohólico de las hojas y tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra” en íleon aislado de rata. Ayacucho 2022. 64 Anexo 16 Prueba Tukey de la altura de las contracciones del íleon por efecto de la acetilcolina 2x10-1 M, atropina 1x10-4 M, N-Butilbromuro de hioscina 1x10-3 M y las concentraciones de 2mg/ml, 1mg/ml y 0,5mg/ml del extracto hidroalcohólico de las hojas y tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra” en íleon aislado de rata. Ayacucho 2022. 65 Anexo 17 Matriz de consistencia 66 ix RESUMEN Las enfermedades gastrointestinales son consideras un problema de salud pública en el Perú, en su mayoría los espasmos gastrointestinales. El objetivo fue evaluar el efecto antiespasmódico del extracto hidroalcohólico de las hojas y tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra” en íleon aislado de ratas; realizado en el laboratorio de farmacología, ambiente de la escuela de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de San Cristóbal de Huamanga, la muestra fue recolectada en el distrito de Ocros (centro poblado Ninabamba), provincia de Huamanga del departamento de Ayacucho. La extracción hidroalcohólica se realizó con etanol al 70%, separando las hojas y tallos en diferentes recipientes, luego se realizó el tamizaje fitoquímico según Miranda, donde se identificó la presencia de flavonoides, alcaloides, taninos, catequinas, azucares reductores, lactonas, triterpenoides - esteroides, saponinas, fenoles, aminoácidos y resinas. El efecto antiespasmódico se determinó con el método de Magnus, induciendo contracciones al íleon con acetilcolina 2x10-1M y como tratamientos la atropina 1x10-4 M, N-Butil bromuro de hioscina 1x10-3 M, 2 mg/ml, 1 mg/ml y 0,5 mg/ml del extracto hidroalcohólico de hojas y tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”, por separado. Los resultados fueron registrados por el transductor del Quimógrafo PanLab, donde la concentración de 2 mg/ml del extracto de tallos y hojas mostraron mayor eficacia antiespasmódica con una inhibición contráctil de 99,98% y 91,98 % respectivamente, mucho mayor que las otras concentraciones y más efectivo que la hioscina (95,93 %) y atropina (83,88 %), respectivamente. En conclusión, el extracto hidroalcohólico de las hojas y tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra” tienen efecto antiespasmódico. Palabras claves: Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”, efecto antiespasmódico. 1 I. INTRODUCCIÓN Las enfermedades gastrointestinales son consideradas un problema de salud pública en el Perú, dentro de ellos están los trastornos gastrointestinales funcionales, que se caracterizan por la aparición de síntomas predominantes como el dolor abdominal, la hinchazón o distensión1 y la contorsión espontánea de los músculos digestivos.2 Mejorar la comprensión de los trastornos gastrointestinales, es mejorar la calidad de vida.3 Los espasmos gastrointestinales son contracciones tónicas involuntarias que persisten en los músculo de fibra lisa, cuando se incrementan los espasmos se le considera anormal,4 para lo cual existen distintos tipos de tratamiento donde los antiespasmódicos son los fármacos de primera línea para tratarlo,5 algunos antiespasmódicos son de origen natural como los alcaloides obtenidos de diferentes plantas, en especial de la belladona (atropina y escopolamina) que actúan disminuyendo el tono muscular y la motilidad intestinal, impidiendo la despolarización de la célula muscular y su consiguiente contracción.6 Los metabolitos secundarios con efecto antiespasmódico fueron flavonoides, terpenos y principalmente los alcaloides.7 El uso de la medicina alternativa se ha incrementado a nivel mundial, debido a las efectos secundarios que presentan los fármacos sintéticos, por lo tanto las plantas medicinales son una de las primeras opciones para tratar ciertos males que aquejan a los pobladores, donde diversos estudios de investigación con plantas medicinales demuestran que cierta cantidad de metabolitos secundarios tienen efecto antiespasmódico, principalmente los flavonoides (33%), alcaloides (22%) y terpenos (25,3%).8 El empleo tradicional de las hojas y tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra” va desde tratamientos 2 relacionados a eventos gastrointestinales como antiespasmódico o antidiarreico, también es usado para temas de impotencia sexual. La importancia de este estudio tiene como finalidad demostrar que esta especie tiene efecto antiespasmódico, usando como tratamiento al extracto hidroalcohólico de las hojas y tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra” en íleon aislado de rata. Se aplicaron métodos para la extracción correcta de los metabolitos y se usó el método farmacológico de Magnus modificado por Jorge Arrollo para evaluar el efecto antiespasmódico por medio de la inducción con acetilcolina y como fármacos estándares la atropina 1x10-4 y hioscina 1x10-3 en comparación de las diferentes concentraciones del extracto. Por tal motivo este trabajo tiene como finalidad evaluar el efecto antiespasmódico de las hojas y tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”, tomando en cuenta los siguientes objetivos: Objetivo general Determinar el efecto antiespasmódico del extracto hidroalcohólico de las hojas y tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra” en íleon aislado de rata. Objetivos específicos • Identificar los metabolitos secundarios presentes en el extracto hidroalcohólico de las hojas y tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”. • Determinar la concentración del extracto hidroalcohólico de las hojas y tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra” que muestre mejor efecto antiespasmódico. • Comparar el efecto antiespasmódico del extracto hidroalcohólico de hojas y tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra” frente a la atropina y N-butil bromuro de hioscina. 3 II. MARCO TEÓRICO 2.1. Antecedentes En las últimas dos décadas ha resurgido la búsqueda de nuevos fármacos que emergen del mundo vegetal, donde los curanderos entrevistados que utilizan plantas medicinales, resaltan que casi una tercera parte de los remedios herbolarios está orientada a distintas enfermedades del aparato digestivo,9 por lo que se estudia la gran diversidad de sustancias con variada estructura química capaces de inhibir las contracciones del músculo liso intestinal.6 En los diversos estudios de investigación se empleó preferentemente el íleon aislado de cobayo o de rata. Los compuestos antiespasmódicos fueron flavonoides, terpenos y principalmente los alcaloides.7 El género Cnidoscolus pertenece a la familia Euphorbiaceae y en la actualidad cuenta con 50 especies aproximadamente, están distribuidas especialmente en el sur de América y son fáciles de diferenciar por la presencia peculiar de tricomas simples o estrellados que pueden llegar a medir hasta 0,6 cm. Dentro de la biodiversidad de Ayacucho y Huancavelica se incluyen estas plantas alto-andinas que son medicinales y aromáticas, generando un valor socioeconómico muy importante entre los habitantes de estas regiones. El Perú es reconocida por su potencial naturaleza con capacidad nutricional y medicinal,10 de las cuales Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra” es nueva especie para la ciencia y de suma importancia por presentar cierto tratamiento hacia los problemas relacionados a trastornos gastrointestinales. Los antecedentes registrados y revisiones bibliográficas denotan que no existen estudios que demuestren el efecto antiespasmódico del extracto hidroalcohólico de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”. 4 En Ayacucho, dentro de la Universidad Nacional de San Cristóbal de Huamanga se realizaron diferentes trabajos de investigación sobre efecto antiespasmódico de varias especies tales como: Saavedra11, en el 2018 realizó el trabajo de investigación titulado efecto antiespasmódico del extracto hidroalcohólico del rizoma de Perezia coerulescens Wedd “mancharisqa” en íleon aislado de Cavia porcellus “cobayo”, demostrando que el extracto hidroalcohólico al 16% fue la mejor, porque logró reducir la actividad contráctil en un 53,6 % asemejándose al patrón de atropina, logrando así disminuir las contracciones musculares generadas con acetilcolina. Identificó la presencia de cumarinas, flavonoides, esteroides, compuestos fenólicos y alcaloides. Para la determinación del efecto antiespasmódico usó el método de Magnus. Flores12, en el año 2015 realizó el trabajo titulado ¨Efecto antiespasmódico del extracto hidroalcohólico de las hojas de Chenopodium ambrosoides L. "paico" en íleon aislado de Cavia porcellus "cobayo". La extracción lo realizó con etanol al 70%, se obtuvo el extracto blando evaporando a sequedad. El tamizaje fitoquímico demostró la presencia de alcaloides, flavonoides, taninos, compuestos fenólicos, compuestos triterpénicos y/o esteroides, cumarinas y aminoácidos que posiblemente son los que generan este efecto antiespasmódico. Evaluó el efecto antiespasmódico mediante el método modificado de Magnus, determinando así que el extracto hidroalcohólico de las hojas de Chenopodium ambrosoides L. "paico" al 20% presenta mayor actividad antiespasmódica (altura de relajación 3,47 mm) semejante al de la atropina (respuesta de relajación 3,36 mm). La técnica in vitro que usó permitió sustentar la hipótesis sobre su uso tradicional. Quilla8, en el año 2013 realizó el trabajo que lleva por título Actividad antiespasmódica del extracto hidroalcohólico de las hojas de Otholobium pubescens (Poir.) J.W. Grimes "wallwa" en íleon aislado de rata. Las hojas fueron colectadas del distrito de Huamanguilla, provincia de Huanta - Ayacucho, realizado en la Universidad Nacional de San Cristóbal de Huamanga. La extracción se realizó con etanol al 80%, evaporando a sequedad para luego realizarle los ensayos fitoquímicos, demostrando la presencia de ciertos metabolitos secundarios como alcaloides, flavonoides, compuestos fenólicos, taninos, terpenos, cumarinas, aminoácidos y catequinas. Evaluó el efecto antiespasmódico del extracto hidroalcohólico en las concentraciones de 15%, 20% y 30%. Los resultados se concluyeron que el extracto hidroalcohólico 5 de Otholobium pubescens (Poir.) J.W. Grimes "wallwa" sí tiene actividad antiespasmódica mostrando mejor efecto al 30% (2,36 mm), estadísticamente similar al patrón de la atropina con una respuesta de 2,14 mm. Villavicencio4, en el año 2017 realizó un estudio de investigación que lleva por título Evaluación de la actividad antiespasmódica del extracto hidroalcohólico de hojas de Porophyllum ruderale (Jac.) cassini “rupay wachi” sobre íleon aislado de Cavia porcellus “cobayo”. Las hojas fueron recolectadas del barrio Santa Ana, específicamente en el centro poblado de Qochapampa del distrito Ayacucho a 2800 msnm, lo realizó en la Universidad Nacional de San Cristóbal de Huamanga. El extracto hidroalcohólico fue evaluado en las concentraciones de 1%, 4% y 8% y usó como fármaco patrón la atropina. Villavicencio realizó el tamizaje fitoquímico y evidenció la presencia de alcaloides, resinas, flavonoides, compuestos fenólicos, catequinas, quinonas y lactonas. Los resultados de las alturas de contracciones fueron de 7,06 mm con la atropina, 8,70 mm con el extracto al 1%, con el extracto al 4% una altura de 8,45 mm y 8,14 mm con el extracto al 8%. Concluyendo que el extracto hidroalcohólico de Porophyllum ruderale (Jac.) cassini “rupay wachi” tiene actividad antiespasmódica, siendo la concentración al 8% la de mayor actividad antiespasmódica similar a la atropina. Valenzuela et al 13, en el año 2015 realizaron un estudio de investigación sobre Cnidoscolus chayamansa hidropónica orgánica y su capacidad hipoglucemiante, calidad nutraceútica y toxicidad. Se utilizaron las hojas maduras que fueron recolectadas del invernadero del Instituto Tecnológico de Torreón (Torreón, Coahuila, México), fueron secadas en temperatura ambiente en un lapso de 15 días y consecuentemente trituradas. Realizaron la preparación de infusión mezclando 5 g de la muestra en 100 ml de agua a 90 °C, dejándolo hervir durante 10 min y finalmente filtrarla. Usaron como fármaco patrón a la glibenclamida, realizando una administración de 30 días en condiciones de ayuno, donde se observó que el tratamiento con la infusión de chaya redujo notablemente los niveles de glucosa teniendo mayor efecto que la glibenclamida, logrando disminuir la glucosa de 180- 240 mg/dl. Valenzuela et al cuantificaron el contenido fenólico usando el método Folin-Ciocalteau con un resultado de 6,34 mg equiv. de ác. gálico/ml y obtuvieron una capacidad antioxidante de un valor de 5.9 mM equiv. de Trolox/ml, posiblemente por la presencia de catequina y rutina, usaron métodos de ABTS+ y DPPH+. La evaluación 6 de toxicidad comprobó que la infusión es segura. Concluyendo que C. chayamansa tiene calidad nutraceútica y un potente efecto hipoglucemiante. Prado14, en el año 2013 realizó un trabajo de investigación sobre el Efecto antiespasmódico del extracto hidroalcohólico de las hojas de Tanacetum parthenium (L.) Sch. Bip. "santa maría" en intestino de ratas Wistar. Sus hojas fueron colectadas en el distrito de Uripa, provincia de Chincheros, región Apurímac y lo realizó en la Universidad Nacional de San Cristóbal de Huamanga. Prado utilizó la atropina y loperamida como fármacos patrones en comparación al extracto hidroalcohólico de las hojas de Tanacetum parthenium (L.) Sch. Bip. "santa maría" sobre las contracciones del íleon que fueron generadas con el patrón indicador (carbón activado). El extracto hidroalcohólico fue sometido a reacciones de coloración y precipitación reportando la presencia de catequinas, lactonas, triterpenoides – esteroides, saponinas, fenoles y taninos, quinonas, flavonoides y alcaloides. En los resultados, se demuestra que el porcentaje del tránsito intestinal obtenido por la acción de la loperamida y atropina fueron de 21,9 y 17,8% mientras que, con los extractos a concentración de 100, 200 y 400 mg/kg fue de 56,8; 42,6 y 24,5 % respectivamente, concluyendo que el extracto hidroalcohólico de Tanacetum parthenium (L.) Sch. Bip. "santa maría" tiene efecto antiespasmódico, siendo la dosis de 400 mg/kg el de mejor efecto antiespasmódico, con un porcentaje de tránsito intestinal de 24,5 % similar al de la loperamida (21,9%). En los ensayos de toxicidad demostraron que a la dosis de 2000 mg/kg el extracto hidroalcohólico no es tóxico. Lope15, en el año 2015 realizó un estudio de investigación de titulo Efecto antiespasmódico del extracto hidroalcohólico de las hojas del Solanum radicans L. "ñuqku" en Íleon aislado de cobayo, ejecutado en la Universidad Nacional de San Cristóbal de Huamanga. Lope usó como inductor a la acetilcolina y como fármacos patrones N-butil bromuro de hioscina y atropina en comparación a las concentraciones de 10%, 15%, 20% y 30% del extracto hidroalcohólico de Solanum radicans L. "ñuqku", los resultados mostraron que Solanum radicans L. "ñuqku" tienen menor efecto antiespasmódico en comparación con la atropina (5,18 mm) y N- butil bromuro de hioscina (5,68 mm), siendo la concentración al 30% (6,16 mm) la de mayor efecto antiespasmódico semejante al de la atropina. Las concentraciones de 10%, 15% y 20% lograron disminuir la altura de la contracción a 7,56; 6,74 y 6,42 mm respectivamente, lo cual no fueron consideradas por presentar una mínima inhibición. 7 El tamizaje fitoquímico evidenció la presencia de metabolitos secundarios tales como los alcaloides, flavonoides, taninos, azucares reductores, compuestos fenólicos, triterpenos y esteroides. Quispe16, en el año 2016 realizó un estudio de investigación sobre el efecto antiespasmódico y toxicidad aguda del extracto acuoso de las hojas de Solanum americanum Muller (Ñushco) sobre el íleon aislado de cobayo, lo realizó en la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Facultad de Farmacia y Bioquímica. Las contracciones en el íleon fueron inducidas con acetilcolina e histamina, incrementando el calcio a nivel intracelular y despolarizando los canales de calcio respectivamente, donde usó la atropina y N-butil bromuro de hioscina como fármacos patrón de la inhibición de la motilidad gastrointestinal. También demostró que el extracto contiene taninos y saponinas. Los resultados obtenidos demostraron que el extracto acuoso de las hojas de Solanum americanum Muller (Ñushco) inhibe la motilidad gastrointestinal, resaltando que se obtuvo menor motilidad a la dosis de 500 mg/kg, los metabolitos del extracto acuso demostraron el efecto antiespasmódico. Los ensayos de toxicidad demostraron que la dosis mayor a 2 000 mg/kg del extracto acuoso de las hojas de Solanum americanum Muller (Ñushco) causa una toxicidad aguda. Kuri et al 17, en el año 2017 realizaron un estudio de investigación que titula perfil fenólico y capacidad antioxidante de Cnidoscolus chayamansa y Cnidoscolus aconitifolius: una revisión. En la extracción acuosa usaron hojas secas de Cnidoscolus aconitifolius donde se encontraron compuestos fenólicos como fenoles 1,86 %, taninos 0,93%, flavonoides 0,30 %, antraquinonas y flobotaninos. El extracto acuoso de C. chayamansa tiene compuestos fenólicos como la quercetina (flavonoide), rutina y catequinas, reportando una capacidad antioxidante de 5,9 mM Trolox equivalentes/ml. También analizaron el extracto hidroalcohólico de las hojas de C. aconitifolius donde se evidenció la presencia de sulfato de hispidulina, eucaliptina, cumarina y lignina. En conclusión, C. chayamansa y C. aconitifolius presentan diferentes compuestos fenólicos como los flavonoides, taninos, fenoles y cumarinas, usado como agente reductor de los niveles de glucosa, como posible agente quimioprotector contra el cáncer de colon. Us et al 18, en el año 2020 realizaron un estudio de investigación sobre la actividad antioxidante y antiinflamatoria in vitro de extractos de chaya (Cnidoscolus 8 aconitifolius (Mill.) I.M. Johnst). Utilizaron las hojas debidamente secas, recolectadas en la Quinta los Achiotes, Yucatán, México, los metabolitos se extrajeron en una maceración solido-liquido 1:10 no secuencial con agua, acetona, etanol, eter dietílico, acetato de etilo y hexano, finalmente la muestra se liofilizó. Los resultados de los análisis de la presencia de compuestos demuestran la presencia de fenoles, donde se observó que la extracción con etanol obtuvo mayor contenido de fenoles, flavonoides 47,76 g/100 g y gran contenido de flavanonas y dihidroflavonoles con 70,10 g/100 g de extracto liofilizado. La presencia de estos compuestos posiblemente genere la actividad antioxidante mostrando un 41,02 % de inhibición inflamatoria del extracto etanólico. En la evaluación de la actividad antiinflamatoria resalta la extracción acuosa mostrando una viabilidad celular inferior al 80%, estos compuestos polifenólicos tienen capacidad antioxidante y reductora del estrés oxidativo de procesos inflamatorios. C. aconitifolius presenta terpenoides que inhiben la actividad de la ECA. Los estudios citotóxicos demuestran que los extractos acuoso y etanólico no producen efectos citotóxicos. Se concluye que C. aconitifolius presenta actividad antioxidante y antiinflamatoria por reducir los radicales DPPH, ABTS y disminuir la expresión génica de las citoquinas. 2.2. Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra” 2.2.1. Clasificación taxonómica DIVISIÓN : MAGNOLIOPHYTA CLASE : MAGNOLIOPSIDA SUB - CLASE : ROSIDAE ORDEN : EUPHORBIALES FAMILIA : EUPHORBIACEAE GÉNERO : CNIDOSCOLUS ESPECIE : Cnidoscolus Diacanthus (Pax. & Hoffm.) Macbr. N.V. : “Huanarpo hembra” 19 e “inca itaña”20 Fuente: Constancia de clasificación taxonómica realizado por la Blga. Laura Aucasime Medina, especialista en taxonomía. (Anexo 1) 9 2.2.2. Descripción botánica Es una planta sustanciosa de crecimiento arbustivo que presenta ramas que llegan a medir 2 m de altura. El tallo es monoico leñoso, presenta una savia lechosa y yemas unidas al peciolo con ramificaciones que emanan desde el suelo y nudos conectados al peciolo de la hoja. El color del tallo puede variar según el tiempo de vida que tiene la planta, entre menor tiempo de vida más tierna y verde serán los tallos.21, 22 Presenta hojas pecioladas de 20 cm de largo y 10 cm de ancho, son gruesas y alargadas de color amarillenta que contiene savia lechosa, sin pubescencia y una base sagitada con presencia de glándulas, son planas y simples de forma lanceoladas con margen dentado con la presencia de pelos urticantes, presenta un ápice puntiagudo y una nervadura penninervada. Las flores son pequeñas de color blanco que se encuentran en racimos dialipétalas del tipo rosácea por presentar 5 pétalos de color blanco en forma de disco. Son unisexuales, presenta disco velloso, ovario trilocular, dicotómicamente dividido o palmi-laciniados, estilo de la base soldada. En cuanto al fruto, rara vez se producen, son capsulares de forma elíptica, normalmente hispido-urticante dividido en 3 mericarpios bivalvos. Semillas llanas con carúncula,19 frutos con cáscaras secas y semillas carunculadas y endospermo conspicuo , cotiledón ancho y más grande que la radícula. 2.2.3. Habitad y distribución geográfica Se distribuyen en áreas tropicales y subtropicales, principalmente en regiones de selva baja que oscilan entre los 1 550 a 3 000 msnm, principalmente en campos xerófilos y arbustivos. Cnidoscolus diacanthus es una especie resistente a las lluvias intensas y sequías, esta especie puede ocupar lugares desérticos con suelos: arcilloso, areno-arcilloso, tipo matorrales con arbustos pequeños, que tienen un clima cálido con una temperatura 15- 30ºC y una humedad atmosférica de 60-90%.23, 24 Características fenológicas: Esta especie se propaga mediante sus semillas, entre los meses de diciembre-abril siendo su época de floración.(19) 2.2.4. Composición química Jiménez et al. mencionan que en la identificación fitoquímica de las hojas de Cnidoscolus se encontraron la presencia de ácido ascórbico, proteínas, β-caroteno, vitaminas, calcio, potasio y hierro. Según Valenzuela et al. mencionan que Cnidoscolus presenta componentes con efecto hipoglucemiante las cuales pueden ser atribuidos por la presencia de catequina y rutina.25 Otros metabolitos encontrados https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/endosperm https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/endosperm https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/cotyledon 10 en esta especie fueron la presencia de antraxquinona combinada y la antraquinona liberada. 2.2.5. Propiedades farmacológicas La presencia de ciertos metabolitos encontrados en esta especie Cnidoscolus, muestran efectos gastrointestinales por acción de los flavonoides, alcaloides y taninos. Según estudios demuestran que Cnidoscolus posee un alto potencial sobre el tratamiento de la diabetes mellitus, por poseer propiedades antioxidantes. Cnidoscolus ha demostrado tener un mayor efecto hipoglucemiante en comparación a la glibenclamida, como agente hipoglucemiante se le considera a la catequina y rutina. Cnidoscolus también presenta propiedades diuréticas esto gracias a la gran cantidad de compuestos fenólicos, especialmente los flobataninos.25 En el año 2007, Awoyinka O. demostró la presencia de taninos en Cnidoscolus las cuales poseen un papel importante teniendo como propiedad farmacológica la actividad antidiarreica y antihemorrágica, esta especia también presenta saponinas donde se le atribuye la actividad de hipotensoras y estimulantes en casos de insuficiencia cardiaca, como tratamiento de la hipertensión. 2.2.6. Usos tradicionales En las zonas rurales de la región de Ayacucho, los metabolitos secundarios de Cnidoscolus son usados por su valor nutricional y sus propiedades terapéuticas especialmente vinculado a la diabetes mellitus, consumiéndolas en infusión de la hoja lo cual disminuye los niveles de glucosa. En la medicina natural fue utilizado para combatir problemas de la piel, problemas oculares, cálculos renales, antitusivo, antiasmático, expectorante bronquial, depurativo, relajante vascular, sedante, obesidad, antibacteriano, hipoglucemiante (como coadyuvante en la anemia), (25)diabetes, gripe, infecciones estomacales, reumatismo y como afrodisíaco, probablemente por la presencia de alcaloides, que es un potente reconstituyente sexual.19 Dicho todas las propiedades terapéuticas atribuidas a esta especie, se aprovecha los tallos y las hojas de “huanarpo hembra” en donde se encuentran la gran mayoría de sus metabolitos secundarios como los flavonoides, alcaloides, azucares reductores, taninos, catequinas, lactonas, triterpenoides - esteroides, saponinas, fenoles, aminoácidos y resinas. Gracias a estos metabolitos se genera el efecto farmacológico que actúa sobre problemas gastrointestinales, usado como antiespasmódico.26 11 2.3. Metabolitos secundarios con propiedades antiespasmódicas 2.3.1. Flavonoides: Los flavonoides son la clase más abundante que se originan del metabolismo secundario de los vegetales a través de la ruta biosintética mixta (ruta del ácido shikímico y la ruta de los Policétidos), son derivados de aminoácidos aromáticos, fenilalanina y tirosina27 además estos compuestos presentan propiedades antioxidantes, antiinflamatoria y antiespasmódica11, son capaces de suprimir la formación de radicales libres, generando relajación en los músculos lisos. Los flavonoides están formados por 2 grupos bencénicos unidos por un puente tricarbonado. Los flavonoides con efecto antiespasmódico prolongan el tiempo de tránsito en el intestino delgado, inhibiendo la tensión de la contracción fásica (movimiento de parición rápida), antagonizando las contracciones inducidas por la acetilcolina. Los flavonoides están divididos en subgrupos, las más destacadas son: Flavonoles monoméricos (catequinas) y flavanonoles (compuesto incoloro o ligeramente amarillo que presenta una baja concentración, por lo que no tiene demasiada importancia, a diferencia de sus glicósidos que sí son realmente importantes como son la hesperidina y naringina).27, 28, 29, 30 O A C B 2 3 45 6 7 8 2´ 3´ 4´ 5´ 6´ Figura 1. Estructura básica de flavonoides 2.3.2. Taninos: Los taninos son un extenso grupo de compuestos hidrosolubles con estructuras polifenólicas, capaces de precipitar algunas macromoléculas como las proteínas, alcaloides y la celulosa,11 la cual se le consigna la propiedad astringente que ejerce un efecto antidiarreico, disminuyendo el peristaltismo por vía interna y externa impermeabilizando las capas de la dermis y mucosas con efecto vasoconstrictor sobre los vasos más superficiales.14 12 OH O OH OH OH Figura 2. Estructura básica de taninos 2.3.3. Alcaloides: Los alcaloides son compuestos antiespasmódicos de origen natural,14 son sustancias nitrogenadas y tienen propiedades fisiológicas ejerciendo fundamentalmente en el sistema nervioso central. Los alcaloides son de gran importancia por presentar la mayor actividad farmacológica,15 por ejemplo la atropina, escopolamina, papaverina.8 O O CH3 CH3 N O CH3 O CH3 Figura 3. Estructura básica del alcaloide 2.3.4. Cumarinas Las cumarinas tienen actividad antiespasmódica, aunque no tienen la debida atención. “Las cumarinas son derivados de la α-benzopirona que generan fluorescencia frente a la luz UV. También poseen acciones antiinflamatorias, sedantes, fotosensibilizadoras (furanocumarinas), ligero efecto hipnótico, acción vitamínica P, anticoagulantes y vasodilatadores coronarios”.11 2.4. Intestino delgado 2.4.1. Anatomía y fisiología del intestino delgado. El intestino delgado es un órgano que forma parte del aparato digestivo y está compuesto de tejido muscular liso, formada por fibras (células del musculo liso). Es 13 llamado liso porque visualmente estas no se estructuran en forma de sarcómeros, compuesta por una superficie que absorbe agua, electrólitos y otros nutrientes. La pared del intestino delgado está constituida por capas internas y externas: la muscularis mucosae, la submucosa, la musculosa y la serosa, mide aproximadamente cinco a ocho metros en el adulto y tiene la estructura de un tubo alargado, abarcando desde el duodeno, el yeyuno y termina en el íleon.16 El íleon se ubica entre la curvatura del duodeno-yeyunal, en su extremo proximal y la unión ileocecal en el extremo distal, muestra una gran vascularización arterial y venosa: vasos mesentéricos superiores y un gran drenaje linfático. El intestino delgado genera dos tipos de movimientos: • Propulsión o peristaltismo: movimientos de contracción para el tránsito del quimo, mediante los músculos longitudinales. • Mezcla: realizan contracciones rítmicas sin progresión, por medio de movimientos segmentarios y movimientos peristálticos débiles generado por los músculos circulares.12 2.4.2. Motilidad gastrointestinal. La motilidad gastrointestinal es la propiedad que tiene el intestino para contraerse y relajarse para lograr que el contenido del intestino vaya de un lugar a otro, la cual favorece la absorción adecuada de los nutrientes. El Sistema nervioso entérico es una estructura involucrada en la contracción del musculo liso donde los neurotransmisores pre y post-sinápticos son excitadores como inhibidores con acción rápida o lenta que condicionan las respuestas contrayéndose o relajándose respectivamente, las cuales han sido las determinantes para conocer el grupo de patologías llamadas trastornos gastrointestinales.32 La contracción celular originada en el musculo liso surge gracias a la liberación del calcio almacenado en el retículo sarcoplasmático. La musculatura lisa se encuentra bajo el dominio del sistema nervioso visceral y trabaja de manera autónoma por presentar una inervación muy compleja.33 Las contracciones del musculo liso se generan por la presencia: • Proteínas contráctiles: Actina y Miosina II (fibra larga). • Proteínas reguladoras: Cinasa de las cadenas ligeras de la miosina (MLCK) y calmodulina. 14 2.4.2.1. Espasmo, contracción y tensión muscular del íleon. Son contracciones involuntarias que se presentan en el músculo liso de forma brusca y violenta de forma persistente.4 Estos espasmos que provocan dolor pueden llegar a durar entre segundos o hasta incluso horas, en ciertas ocasiones va acompañado con vómitos o nauseas. Generalmente son causadas por alguna patología digestiva, también se genera de manera espontánea sin causa aparente o por una mala alimentación (alimentos en descomposición entre otros).11 Estos espasmos son ocasionados por el incremento de la tensión muscular la cual es la sumatoria de dos factores distintos: el tono viscoelástico y la actividad contráctil. El tono viscoelástico se divide en la rigidez viscoelástica y la rigidez elástica. Cabe resaltar que la velocidad contráctil se debe al tono viscoelástica y los movimientos espasmódicos se debe a la rigidez elástica y por consecuente un conjunto de contracciones constantes. La contractura, el espasmo electrogénico (patológico) y la rigidez electrogénica son compuestos de la actividad contráctil. La de menor importancia es la contractura, porque no produce registro electromiográfico a diferencia del espasmo electrogénico que refiere a la contracción involuntaria muscular de manera patológica. Esta contracción muscular involuntaria patológica es el resultado de la tensión muscular la cual es referida como la rigidez electrogénica. El cólico se define como la presencia de dolor agudo, intenso y agotador en ciertos casos, cuyo origen se encuentra en el aparato gastrointestinal. Se origina por el incremento de tensión de las contracciones del músculo liso. Clínicamente el dolor generado por los espasmos gastrointestinales es tratado con drogas que relajan el músculo liso, siendo los antiespasmódicos la mejor opción terapéutica para tratarlos.12, 16 2.4.3. Neurotransmisión colinérgica del tracto gastrointestinal. La función gastrointestinal es regulada de forma autónoma por el sistema nervioso entérico, presenta gran cantidad de neuronas intrínsecas y una diversidad de neurotransmisores, especialmente los neuropéptidos. De forma que, este sistema controla la microcirculación del tubo digestivo, la motilidad y las secreciones exocrinas y endocrina, participando en la regulación de sus procesos inflamatorios e inmunológicos.12 El Sistema Nervioso Entérico es la parte más compleja del sistema nervioso periférico, originando a los plexos nerviosos: 15 • Plexo submucoso (Meissner), se encarga de regular las funciones de digestión y sobre su anabolismo a nivel de los vasos sanguíneos y la mucosa. • Plexo mientérico (Auerbach), se encarga de coordinar la actividad de las capas musculares controlando los movimientos gastrointestinales.16, 34 La actividad autónoma del sistema nervioso entérico es responsable de las contracciones espontaneas y el peristaltismo en el músculo liso intestinal del íleon,16 la propulsión del contenido alimenticio en dirección anal es controlada por las neuronas motoras del plexo mientérico, consideradas como neuronas postsinápticas del sistema parasimpático que interactúan con la mucosa intestinal y las células del músculo liso.11 El neurotransmisor de las fibras del sistema parasimpático es la acetilcolina que se encuentra en el ganglio y también está presente en el órgano efector como la motoneurona espinal encargada de los movimientos. La liberación de la acetilcolina se realiza gracias a las motoneuronas colinérgicas excitadoras que se encuentran conectadas a las fibras musculares a través de botones terminales del axón presináptico, las cuales liberan a las vesículas sinápticas.35 La acetilcolina al interactuar con los receptores muscarínicos y nicotínicos causan despolarización y contracción del músculo liso intestinal.16 Los receptores muscarínicos y nicotínicos están localizados en la membrana de las células musculares lisas. Estos receptores muscarínicos y nicotínicos al interactuar con su agonista como la acetilcolina generan procesos fisiológicos, logrando así la contracción del musculo liso gastrointestinal.28 Los receptores muscarínicos están divididos en subtipos, siendo el receptor subtipo M3 del tracto gastrointestinal específicamente del musculo liso localizado en las células secretoras y en las células musculares lisas, incrementan secreciones digestivas y contracción gastrointestinal. Los receptores nicotínicos permiten la apertura de los canales iónicos que aumentan la permeabilidad del calcio y sodio.28 En la preparación de íleon de cobayo se encontraron los receptores muscarínicos y nicotínicos situados postsinápticamente en las células del músculo liso, estos receptores son captados por sus agonistas como la acetilcolina que genera contractilidad del músculo liso o alguna otra sustancia que produce una inhibición directa de la contracción.35, 37 16 2.4.4. Acetilcolina Es un neuropéptido (pequeña proteína) que funciona como un neurotransmisor29 del sistema nervioso parasimpático, tiene receptores colinérgicos nicotínicos y muscarínicos,38 los receptores muscarínicos y nicotínicos son específicamente receptores de la acetilcolina.37 La acetilcolina es sintetizada en el citoplasma neuronal mediante la acción de la enzima colinoacetiltransferasa (ChAT), que interviene a partir de la colina y la acetilcoenzima A (Acetil-CoA) que es sintetizada en las mitocondrias,39 luego es almacenada en una vesícula sináptica y finalmente es secretada en el transcurso de la estimulación neuronal de acción presináptica, cuando esta incrementa las concentraciones citosólicas de Ca2+ (a través de los canales de calcio), logrando la fusión de la vesícula con la membrana presináptica, difundiendo la acetilcolina hacia el espacio sináptico para después interactuar con sus receptores específicos situados unos en la membrana postsináptica.39, 16 O CH3 O NH3 + Figura 4. Estructura química de la acetilcolina 2.4.4.1. Mecanismo de acción de la acetilcolina La acetilcolina aumenta la actividad motora generalmente provocando contracciones o incrementando la fuerza contráctil del musculo liso,37 estimula el peristaltismo del intestino delgado produciendo espasmos gastrointestinales, generando cuadros diarreicos y dolores tipo cólico.39 Por lo tanto, la acción de la acetilcolina en sus receptores colinérgicos de tipo muscarínico M3 y nicotínicos en musculatura intestinal lisa está implicada en la actividad contráctil y excitación del musculo liso. Según Del valle en el año 1991 refiere que “la acetilcolina se ha descrito como el principal neurotransmisor que opera desde el plexo mientérico del íleon y que se encarga de generar contracciones”.16, 35, 40 La contracción muscular se origina a través del siguiente ciclo de la acetilcolina: 17 • Inicia con la despolarización de la célula causada por la acetilcolina, logrando así el paso de los iones de calcio por medio de los canales de tipo L (canales de calcio) que se encuentran en las caveolas (invaginaciones de la membrana). Los iones de calcio penetran a la célula y aumentan la concentración suplementaria de calcio intracelular liberado del retículo sarcoplasmático a través de los canales voltaje- dependientes. • El calcio liberado se une a la calmodulina y la activa. • La calmodulina-activada se una a la cadena ligera miosina cinasa (MLCK) y la activa. • Seguidamente la MLCK activada fosforila la cadena delgada de la molécula de miosina inactiva. • Finalmente ocurre un incremento de la actividad de la miosina ATPasa, generando la interacción entre los filamentos de actina y miosina formando puentes cruzados, es decir la contracción muscular.41 2.4.5. Tratamiento farmacológico. 2.4.5.1. Anticolinérgicos Los anticolinérgicos son fármacos capaces de antagonizar la acción de la acetilcolina sobre sus efectos autónomos, esto se debe a su mecanismo de acción que actúa frente a los espasmos gastrointestinales antagonizando de forma competitiva e impidiendo la despolarización de la célula muscular causada por la acetilcolina logrando reducir las contracciones, disminuyendo el tono muscular y aliviando el dolor del músculo afectado que fue causado por el incremento de la acetilcolina, los antiespasmódicos son los más comunes.12, 16 Los anticolinérgicos más usados son la atropina y sus derivados que bloquean de forma competitiva a los receptores colinérgicos muscarínicos impidiendo la acción de la acetilcolina y por consiguiente evitando ciertos mecanismos de acción como la contracción.39, 40, 42 Existe otro anticolinérgico con un mecanismo de acción de mayor selectividad en los plexos ganglionares mientéricos, son anticolinérgicos con N cuaternario: bromuro de butilescopolamina, bromuro de metilescopolamina y la dicicloverina. Estos fármacos sirven para el tratar ciertas alteraciones motoras digestivas (cólicos, distonías o espasmos).8 18 2.4.5.2. Atropina La atropina (d-l-hiosciamina) es un alcaloide de la Atropa belladona, tiene una forma levógira natural (l-hiosciamina, desviando la luz polarizada hacia la izquierda), es un éster formado por el ácido trópico, tropanol y un grupo hidroxilo libre que gracias a estos se obtiene la actividad antimuscarínica especifica. Por lo que la atropina es el anticolinérgico más potente, pero con una menor incidencia de bloqueo en los receptores nicotínicos, gracias a su mecanismo de acción que bloquea de forma reversible las acciones colinomiméticas (aumento de la acetilcolina) que actúan sobre los receptores muscarínicos, impidiendo la acción de la acetilcolina sobre el músculo liso, disminuyendo la motilidad gastrointestinal. Cuando la atropina se une al receptor muscarínico bloquea de forma competitiva a la acetilcolina e impide que esta despolarice la célula impidiendo el paso de Ca+2 por sus canales respectivos y por consiguiente también evita la liberación del trifosfato de inositol (IP3), la atropina impide la acción de la acetilcolina reduciendo significativamente la tensión muscular y la frecuencia de las contracciones, disminuyendo la velocidad del tránsito intestinal.8, 11, 37, 40 La atropina presenta una estructura no polar para atravesar la barrera hematoencefálica sin complicación alguna y logra desencadenar algunas acciones a ese nivel, no distingue a los receptores muscarínicos selectivos M1, M2 o M3, bloqueando a todos por igual. Por lo tanto, se tiene que respetar la dosis adecuada que no afecten los receptores del ganglio autónomo y la placa neuromuscular.4 OHO O N CH3 Figura 5. Estructura química de la atropina 2.4.5.3. N- Butil bromuro de hioscina Es un anticolinérgico derivado de amonio N cuaternario, a diferencia de la atropina este tiene mejor actividad que interfiere en la transmisión neuromuscular. Según 19 Galindo et al. este fármaco es usado específicamente en acción antiespasmódica que produce bloqueo de receptores nicotínicos en estudios in vitro. Usado como antiespasmódico en condiciones asociadas a espasmos viscerales, aliviando el dolor y disminuyendo la tensión de los espasmos del músculo liso. La hioscina tiene una mayor duración de su mecanismo de acción y no tiene efectos anticolinérgicos en el sistema nervioso central.15, 11 OHO O N + O CH3 CH3 Figura 6. Estructura química de la hioscina 20 III. MATERIALES Y METODOS 3.1. Lugar de ejecución. El presente trabajo de investigación se llevó a cabo en los laboratorios de farmacología de área de Farmacia y Bioquímica de la Salud de la Universidad Nacional de San Cristóbal de Huamanga, durante los meses de junio a noviembre del 2022. 3.2. Materiales. 3.2.1. Población Hojas y tallos de la especie Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”, recolectadas en el distrito de Ocros (centro poblado Ninabamba), provincia de huamanga en el departamento de Ayacucho, a una altitud de 2 073 msnm. 3.2.2. Muestra vegetal Tres kilogramos de hojas y tallos por separado de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra” no cultivadas, recolectados en el distrito de Ocros (centro poblado Ninabamba), provincia de huamanga en el departamento de Ayacucho, a una altitud de 2 073 msnm, muestreadas por conveniencia a horas de la mañana aproximadamente 10 h 00. 3.3. Unidad de experimentación. Se utilizó el íleon aislado de ratas Holtzman machos con pesos promedios entre los 250 ± 40 g, los cuales fueron adquiridos del Bioterio del Instituto Nacional de Salud (anexo 2) transportados y acondicionados en jaulas adecuadas, fueron ubicadas en el bioterio de la escuela de Farmacia y Bioquímica de la Universidad de San Cristóbal de Huamanga durante treinta días con alimentación balanceada y agua. 21 3.4. Procedimiento metodológico para la recolección de datos. 3.4.1. Selección de la muestra vegetal Se recolectaron y seleccionaron los tallos y hojas de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”, extraídas del distrito de Ocros (centro poblado Ninabamba), provincia de huamanga en el departamento de Ayacucho, a una altitud de 2073 msnm, recolectadas a horas de la mañana, para evitar los rayos solares y por consiguiente la traspiración de la planta. Se recolectaron las hojas y tallos en buen estado y con un buen desarrollo biológico. Los tallos y hojas fueron sometidos a un tratamiento de limpieza, seguidamente secadas a temperatura ambiental en una habitación ventilada hasta eliminar la humedad con papel periódico, cambiándola cada 24 horas para su secado. Ya exentos de humedad fueron reducidas de tamaño utilizando un molino de cuchilla, hasta obtener un pulverizado uniforme. En cuanto a la identificación botánica, se recolectó y secó la especie Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”, conteniendo la raíz, el tallo, las hojas y sus flores, fue identificado por la Blga. Laura Aucasime ex docente de la Facultad de Ciencias Biológicas (Anexo 1). 3.4.2. Elaboración del extracto hidroalcohólico de las hojas y tallos. Se obtuvo un peso aproximado de 800 g de muestra seca y molida, tallos y hojas por separado, para luego macerarlas en un frasco de color ámbar de 4L, donde la muestra fue cubierta con 3L de alcohol al 70%. Durante el proceso se agitó el frasco periódicamente para que el alcohol se distribuya homogéneamente en la muestra, por un periodo de dos semanas. Posteriormente se filtró el residuo, el extracto obtenido se llevó al rotavapor con una temperatura de 50°C, para amenguar el contenido de alcohol, luego fue llevada a una estufa con una temperatura de 40 °C para eliminar restos de alcohol. Finalmente se obtuvo un concentrado que fue envasado en un recipiente herméticamente cerrado, por ser muy higroscópico. 3.4.3. Tamizaje fitoquímico. La identificación de los metabolitos secundarios presentes en el extracto hidroalcohólico de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”, se realizó siguiendo las propuestas de Miranda y Cuellar, con pruebas de coloración y precipitación (ver anexo 7 y 8).43 22 3.4.4. Evaluación del efecto antiespasmódico. La determinación del efecto antiespasmódico se llevó a cabo siguiendo el método de Magnus modificado de Jorge Arrollo.44 Materiales: • Acetilcolina, se preparó una concentración de 2x10-1 M. • Ampollas de atropina sulfato 1mg/ml (fabricado por Laboratorio Jiangsu Ruinian Qianjin Pharmaceutical CO., LTD). Se realizo una dilución de 1x10-4 M. • Ampollas de N-Butil bromuro de hioscina de 20 mg/ml (fabricado por Laboratorio Laboratorios Unidos S.A.). Se realizó una dilución de 1x10-3 M. • Extracto hidroalcohólico de hojas a diferentes concentraciones: 2mg/ml, 1mg/ml y 0,5mg/ml. • Extracto hidroalcohólico de tallos a diferentes concentraciones: 2mg/ml, 1mg/ml y 0,5mg/ml. 3.4.4.1. Procedimiento: Método de Magnus modificada por Jorge Arrollo:44 • Las ratas se mantuvieron en ayuna durante 24 horas antes de ser sacrificadas por dislocación cervical. • Se encendió el baño para órganos aislados automático Power Lab y al mismo tiempo el software, para luego equilibrar el quimografo Panlab Harvard. • Posterior a la dislocación cervical se realizó una laparotomía y se aisló una porción terminal del íleon de aproximadamente 12 cm de longitud, cortadas en tres partes iguales siendo un aproximado de 3,5 cm cada trozo de íleon medidas con regla graduada. • Se colocaron las tres porciones de órgano en una placa Petri contenido de líquido nutricio, seguidamente se eliminó restos de capa serosa adherida al íleon. Cada trozo de íleon fue atado de ambos extremos con seda quirúrgica (sin ocluir la luz intestinal). • Al obtener el segmento del íleon preparado, se acomodó en el contenedor del equipo de sistema de órganos aislados, donde en un extremo del íleon se sujeta con la varilla que contacta al detector del quimógrafo y el otro que sujeta al íleon en el fondo. • El vaso contenedor del órgano fue acondicionado con liquido nutricio de composición gramos por litro: NaCl (8,0 g), KCl (0,2 g), CaCl2 (0,2 g), NaHCO3 (1,0 23 g), NaH2PO4 (0,05 g), KH2PO4 (0,15 g) y MgSO4 (1,0 g) con una aireación continua de 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono a una temperatura de 37°C. • Seguidamente se obtuvo una línea basal estable en el software, lo que indicó proseguir con el ensayo. • Luego se inyectó 0,3 ml de acetilcolina en una concentración de 2x10-1 M, para generar contracción del íleon. Donde los resultados se midieron como respuestas contráctiles y se observó durante 25 minutos cada grupo, el grupo I: acetilcolina + cloruro sódico 0,9%. En los grupos II, III, IV, V, VI, VII, VIII y IX se agregó 0,3 ml de acetilcolina 2x10-1 M y se observó durante 13 minutos. • Finalmente, al pasar los 13 minutos tras la inyección de la acetilcolina se inyectó 0,3 ml de atropina 1x10-4 M al grupo II y 0,3 ml de N-Butilbromuro de Hioscina 1x10-3 M al grupo III usados como fármacos estándares. A los grupos IV, V y VI se inyectó 0,3 ml de 2mg/ml, 1mg/ml y 0,5mg/ml del extracto hidroalcohólico de hojas y a los grupos VII, VII y IX se inyectó 0,3ml de 2mg/ml, 1mg/ml y 0,5mg/ml del extracto hidroalcohólico de tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”. La variación de altura de las contracciones fue captada por el transductor del quimógrafo PanLab y registrados en la computadora por el Software LabChart. Se realizó cinco repeticiones por grupo. 3.4.4.2. Diseño experimental: Se empleó un diseño experimental tomando en cuenta el control positivo (atropina y hioscina), control negativo (suero fisiológico) y seis tratamientos (extracto hidroalcohólico de hojas y tallos por separado en concentraciones de 0,5mg/ml, 1mg/ml y 2mg/ml) cada tratamiento manejó 5 repeticiones, representado en el siguiente esquema. Gc Y O Ge X O1 Donde: Gc = grupo control Y = blanco O = observación de las contracciones Ge = grupo experimental X = tratamiento O1 = observación de la disminución de contracciones 24 Tabla 1. Organización experimental para evaluar el efecto antiespasmódico en íleon aislado de rata, Ayacucho 2022. GRUPOS Tratamientos I Blanco II STD II STD IV V VI VII VII IX Acetilcolina 2x10-1 M X X X X X X X X X Suero fisiológico 0,9% X Atropina 1x10-4 M X N-Butilbromuro de hioscina 1x10-3 M X EH Tallos 2 mg/ml X EH Tallos 1 mg/ml X EH Tallos 0,5 mg/ml X EH Hojas 2 mg/ml X EH Hojas 1 mg/ml X EH Hojas 0,5mg/ml X *EHT: Extracto hidroalcohólico de tallos *EHH: Extracto hidroalcohólico de hojas 3.5. Análisis de datos. Los datos obtenidos fueron procesados y analizados con el programa estadístico IBM SPSS Statistics de Windows Vers. 23.0, evaluados a través del Análisis de Varianza (ANOVA) y la prueba de comparaciones múltiples de Tukey para detectar posibles diferencias entre los tratamientos, considerando una significancia (p<0,05). 25 IV. RESULTADOS 26 Tabla 2. Metabolitos secundarios presentes en el extracto hidroalcohólico de las hojas de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”, Ayacucho 2022. Metabolito secundario Ensayo Resultado Observación Flavonoides Shinoda +++ Coloración naranja intenso Alcaloides Wagner +++ Formación de precipitados de color opalescencia Mayer + Dragendorff ++ Catequinas Carbonato de sodio + Luz UV +++ Coloración verde carmelita a la luz UV Azucares reductores Fehling ++ Precipitado naranja Lactonas Baljet ++ Coloración roja- anaranjado Triterpenoides- esteroides Lieberman-Buchard ++ Formación de anillo anaranjado, dividido en dos fases Saponaninas Espuma + Formacion de burbujas Fenoles y taninos Cloruro ferrico +++ Coloracion verde oscuro Aminoacidos Ensayo de ninhidrina ++ Azul violáceo y precipitado Resinas Agua destilada + Precipitado (+): Escaso, (++): Moderado, (+++); Abundante 27 Tabla 3. Metabolitos secundarios presentes en el extracto hidroalcohólico de los tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”, Ayacucho 2022. Metabolito secundario Ensayo Resultado Observación Flavonoides Shinoda +++ Coloración naranja intenso Alcaloides Wagner ++ Formación de precipitados de color opalescencia Mager + Dragendorff +++ Catequinas Carbonato de sodio + Luz UV +++ Coloración verde carmelita a la luz UV Azucares reductores Fehling ++ Precipitado verde oscuro Opalescencia Benedict + Lactonas Baljet ++ Coloración roja Triterpenoides- esteroides Lieberman-Buchard +++ Formacion de un anillo de color anranjado, partido en dos fases Saponaninas Espuma + Formacion de burbujas Fenoles y taninos Cloruro ferrico +++ Coloracion verde oscuro Aminoacidos Ensayo de ninhidrina ++ Azul violáceo y precipitado Resinas Agua destilada ++ Precipitado lechoso (+): Escaso, (++): Moderado, (+++); Abundante 28 * Nivel de significancia p<0,05. Figura 7. Variación de altura de las contracciones del íleon por efecto de la administración de cloruro sódico 0,9 %, acetilcolina 2x10-1 M, atropina 1x10-4 M, N- Butil bromuro de hioscina 1x10-3 M y concentraciones de 2 mg/ml, 1 mg/ml y 0,5 mg/ml del extracto hidroalcohólico de tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”, Ayacucho 2022. 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 Blanco Control Atropina Hioscina EHT 2mg/ml EHT 1mg/ml EHT 0,5mg/ml 3.50 5.27 3.56 3.39 3.36 3.51 3.81 A lt u ra ( m m ) Tratamientos LEYENDA Blanco : Cloruro sódico 0,9 % Control : Acetilcolina 2x10-1 Hioscina : N-Butil bromuro de hioscina 1x10-3 M Atropina : Atropina 1x10-4 M EHT : Extracto hidroalcohólico de tallos EHH : Extracto hidroalcohólico de hojas 29 * Nivel de significancia p<0,05. Figura 8. Variación de altura de las contracciones del íleon por efecto de la administración de cloruro sódico 0,9 %, acetilcolina 2x10-1 M, atropina 1x10-4 M, N- Butil bromuro de hioscina 1x10-3 M y concentraciones de 2 mg/ml, 1 mg/ml y 0,5 mg/ml del extracto hidroalcohólico de hojas de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”, Ayacucho 2022. 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 Blanco Control Atropina Hioscina EHH 2mg/ml EHH 1mg/ml EHH 0,5mg/ml 3.50 5.27 3.56 3.39 3.38 3.70 4.44 A lt u ra ( m m ) Tratamientos LEYENDA Blanco : Cloruro sódico 0,9 % Control : Acetilcolina 2x10-1 Hioscina : N-Butil bromuro de hioscina 1x10-3 M Atropina : Atropina 1x10-4 M EHT : Extracto hidroalcohólico de tallos EHH : Extracto hidroalcohólico de hojas 30 Figura 9. Porcentajes de inhibición contráctil por efecto de la atropina 1x10-4 M, N- Butil bromuro de hioscina 1x10-3 M y concentraciones de 2 mg/ml, 1 mg/ml y 0,5 mg/ml del extracto hidroalcohólico de las hojas y tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra” en íleon aislado de rata. Ayacucho 2022. 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 100.00 Atropina Hioscina EHT 2mg/ml EHT 1mg/ml EHT 0,5mg/ml EHH 2mg/ml EHH 1mg/ml EHH 0,5mg/ml 83.88 95.93 99.98 88.49 66.50 91.98 65.14 52.73 P o rc e n ta je d e i n h ib ic ió n c o n tr a c ti l (% ) Tratamientos LEYENDA Atropina : Atropina 1x10-4 M Hioscina : N-Butil bromuro de hioscina 1x10-3 M EHT : Extracto hidroalcohólico de tallos EHH : Extracto hidroalcohólico de hojas *Nivel de significancia p<0,05. 31 V. DISCUSIÓN El uso de las plantas medicinales como medicina tradicional hoy en día va teniendo más poder, por considerarlas menos tóxicas y de fácil acceso. En la actualidad existen plantas medicinales cuyos efectos farmacológicos no han sido estudiados por completo. La mayoría de estas hierbas contienen metabolitos que son usados para los desórdenes gastrointestinales y que son uno de los principales problemas de salud en el mundo.16 El 80% de la población a nivel mundial opta usar la medicina tradicional como tratamiento de ciertas enfermedades empleando extractos, cocción entre otras formas de extracción de los metabolitos presentes como los flavonoides, alcaloides, taninos, entre otros.11 Hablar de estos trastornos gastrointestinales es hablar que más del 40% de la población experimenta dolor abdominal inexplicable, hinchazón, espasmos intestinales, diarrea o estreñimiento.45 Estos espasmos intestinales son generados por las contracciones de la capa muscular lisa, donde el Ca2+ juega un papel importante en la frecuencia y amplitud de estas contracciones. Hoy solo se cuenta con terapias subóptimas, sintomáticas y que proporcionan un alivio temporal e inconsistente.46 Por tal motivo el estudio de nuevas plantas medicinales que traten problemas gastrointestinales. Dentro de nuestro país se realizaron varios estudios sobre la actividad antiespasmódica, pero el estudio de esta especie Cnidoscolus diacanthus es uno de los primeros en nuestro medio. Este tema de investigación determinó el efecto antiespasmódico del extracto hidroalcohólico de hojas y tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra” en íleon aislado de rata, naturalmente Cnidoscolus es empleada para combatir enfermedades hepáticas, renales, gripe, diabetes, úlcera péptica, infecciones estomacales y reumatismo.25, 47 En la tabla 2 se observan los resultados del tamizaje fitoquímico del extracto hidroalcohólico de hojas de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. 32 “huanarpo hembra” según el método de Miranda y Cuellar,43 resaltando que en su mayoría contiene flavonoides, alcaloides, catequinas, fenoles, taninos y en menor porcentaje se encontraron los esteroides, aminoácidos y los azucares reductores. La presencia de alcaloides en el resultado nos ayuda a esclarecer el mecanismo de acción de este extracto, puesto que usamos como estándar a dos alcaloides como la atropina y N-butilbromuro de hioscina. Cabe resaltar que la concentración del extracto de las hojas se asemeja más al efecto de la hioscina. Según Saavedra, en su estudio de investigación demostró que la activad antiespasmódica del extracto hidroalcohólico del rizoma de Perezia coerulescens Wedd “mancharisqa” en íleon aislado de Cavia porcellus “cobayo”, se debió a la presencia de alcaloides, flavonoides y esteroides,11 las cuales están presentes en este extracto. Asimismo, en el año 2013 Quilla8 determinó la actividad antiespasmódica del extracto hidroalcohólico de las hojas de Otholobium pubescens (Poir.) J.W. Grimes "wallwa" en íleon aislado de rata. Evidenció la presencia de ciertos metabolitos secundarios como alcaloides, flavonoides, compuestos fenólicos, taninos, terpenos, cumarinas, aminoácidos y catequinas, a partir de la extracción etanólica al 80%, según Quilla estos metabolitos fueron los responsables de la actividad antiespasmódica. De igual forma Kuri et al17, afirman que el género Cnidoscolus presenta compuestos fenólicos como fenoles 1,86%, taninos 0,93%, flavonoides 0,30%, antraquinonas y flobotaninos, dentro de este género se encuentra la especie C. chayamansa que presenta compuestos fenólicos como la quercetina, rutina y catequinas, reportando una capacidad antioxidante de 5,9 mM Trolox equivalentes/ml. También demostraron que el extracto hidroalcohólico de las hojas de C. aconitifolius evidenció la presencia de sulfato de hispidulina, eucaliptina, cumarina y lignina. Estos resultados nos ayudan a determinar que Cnidoscolus tiene una gran importancia medicinal sobre los trastornos gastrointestinales, debido a la presencia de quercetina que produce relajación sobre el tono gástrico y por la presencia de los flavonoides que producen efectos relajantes en el musculo liso. En la tabla 3, los resultados del tamizaje fitoquímico del extracto hidroalcohólico de tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra” también fueron favorables por demostrar la presencia de flavonoides, catequinas, alcaloides, esteroides, fenoles, taninos y en menor porcentaje se encontraron los aminoácidos, lactonas y azucares reductoras. Los resultados de este tamizaje concluyen que el 33 efecto antiespasmódico fue gracias a la presencia de estos metabolitos, que en su mayoría fueron los alcaloides, la concentración de este extracto hidroalcohólico de tallos se asemeja al efecto faramacologico de la atropina y la hioscina. Según Flores, demuestra que la presencia de alcaloides, esteroides, flavonoides y taninos en Chenopodium ambrosoides L. "paico" tienen efecto antiespasmódico, relacionándolo con la atropina. Ambos estudios demuestran la presencia de metabolitos secundarios, que en su mayoría son los alcaloides, flavonoides, catequinas y taninos, se resaltan estos metabolitos porque en estudios anteriores se demostraron que estos son los responsables del efecto antiespasmódico.12 Villavicencio también demostró la presencia de metabolitos secundarios con efecto antiespasmódico, de las cuales resalta a los alcaloides, resinas, flavonoides, compuestos fenólicos, catequinas, quinonas y lactonas del extracto hidroalcohólico de hojas de Porophyllum ruderale (Jac.) cassini “rupay wachi”. De igual forma en el año 2020, Us et al18 demostraron que Cnidoscolus tiene actividad antioxidante y antiinflamatoria, debido a la presencia de compuestos fenólicos como los flavonoides, flavanonas y dihidroflavonoles. La presencia de metabolitos secundarios en el extracto hidroalcohólico de hojas y tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra” tienen efecto antiespasmódico especialmente los alcaloides, que son sustancias nitrogenadas y tienen propiedades fisiológicas importantes. Los alcaloides son de gran importancia por presentar la mayor actividad farmacológica15 por ejemplo la escopolamina, atropina, papaverina, entre otros.8 La presencia de los flavonoides también tienen un importante papel en el efecto antiespasmódico, son derivados de aminoácidos aromáticos, fenilalanina y tirosina27 además, estos compuestos presentan propiedades antioxidante, antiinflamatoria y antiespasmódica11 por la capacidad de suprimir la formación de radicales libres, generando relajación en el músculo liso intestinal y disminuyen la tensión de las contracciones fásicas, también se toma en cuenta la presencia de los taninos por poseer propiedades antimicrobiana, anticancerígena y sobre todo la actividad antidiarreica,16 cabe resaltar que los alcaloides también cumplen un papel muy importante en la actividad antiespasmódica, esto gracias a los glicoalcaloides (compuesto químico derivado de los alcaloides, la cual presenta grupos de azúcar) que actúan interfiriendo en la regulación de la acetilcolina.7, 16 Asimismo, se observa que a mayor dosis del extracto mayor efecto relajante presentará. Para la 34 determinación del efecto antiespasmódico se usó el método de Magnus modificada por Jorge Arrollo,44 donde se utilizó como inductor de contracciones la acetilcolina a una concentración de 2x10-1 M y como fármacos patrones la atropina 1x10-4 M y N- Butilbromuro de hioscina 1x10-3 M en comparación a los extractos hidroalcohólicos de las hojas y tallos por separado en concentraciones de 2 mg/ml, 1 mg/ml y 0,5 mg/ml. En la figura 7, se observa la variación de altura de las contracciones del íleon por efecto de la administración de cloruro sódico 0,9 %, acetilcolina 2x10-1 M, atropina 1x10-4 M, N-Butil bromuro de hioscina 1x10-3 M y las concentraciones de 2mg/ml, 1mg/ml y 0,5mg/ml del extracto hidroalcohólico de tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”. El íleon en estado normal presenta una altura promedio de 3,50 mm y que luego al inyectarle 0,30 ml el inductor de acetilcolina 2x10-1 M, el íleon se tensiona incrementando la altura de las contracciones hasta un 5,27 mm en promedio, desde el minuto siete hasta el minuto trece, donde luego se inyectan los fármacos estándares atropina y hioscina (Anexo 13), logrando relajar al íleon dos minutos después de inyectarlo. El incremento de la tensión muscular se debe al mecanismo de acción de la acetilcolina que al ser captada por su receptor nicotínico y muscarínico incrementan el calcio citosólico, donde interviene el sistema nervioso entérico en las capas del músculo liso, el Ca2+ interviene en la frecuencia y amplitud de las contracciones espontaneas del íleon, esta transducción de las contracciones se da gracias a los receptores acoplados a la proteína G y la activación de enzimas que movilizan el Ca2+, en estudios anteriores se demuestra que la quercetina presente en el género Cnidoscolus redujo la amplitud de las contracciones más no lograron controlar la frecuencia de estas y que actúan exclusivamente en adenosinmonofosfato cíclico (AMPc) regulando el paso del Ca2+, por lo que este efecto farmacológico se relaciona con el efecto del “Huanarpo hembra”. Cuando la acetilcolina liberada es captada por su receptor muscarínico (acoplada a una proteína Gq – clase excitatoria) por medio de la entrada de iones Ca2+ a la célula, el mecanismo de contracción se activa gracias al ligando (hormona), tras la unión de estos el guanosín difosfato (GDP) de la subunidad alfa cambia a guanosina trifosfato (GTP) concediéndole mayor energía, donde la subunidad alfa activa a la fosfolipasa c (enzima con acción en la membrana celular) produciendo diacilglicerol (DAG) y el inositol trifosfato (IP3), donde el DAG abre los canales de 35 calcio de la membrana celular y por consiguiente el paso de Ca2+, y el IP3 se dirige al retículo endoplasmático liso para unirse y abrir el canal de reanudina liberando a los iones Ca2+. Por consecuente se incrementa la concentración del ion Ca2+ en el medio intracelular, el ion Ca2+ se une a la calmodulina y forman el complejo calcio- calmodulina, de forma siguiente la fosforilación activa proteínas específicas como la Proteína Quinasa C (PKC) y la Miosina cinasa de la cadena ligera de miosina (MLCK), la cual conllevan la fijación de los puentes de miosina a la actina, produciendo hidrolisis del ATP y seguidamente la contracción muscular o espasmos gastrointestinales las cuales generan cuadros diarreicos y dolores tipo cólico.39 Los fármacos estándares de atropina y N-butibromuro de hioscina registraron una disminución de la tensión hasta llegar al estado de relajación de 3,56 y 3,39 mm respectivamente, resaltando que el de mayor efecto antiespasmódico de los estándares es N- butibromuro de hioscina, por presentar mayor afinidad a los receptores nicotínicos que están presentes en los tratamientos in vitro, pero no dejar de lado a la atropina que también logro llegar a un estado de relajación considerable (3,56 mm), aunque esta tiene mayor afinidad por los receptores muscarínicos. La atropina es un alcaloide que actúa como antagonista de la acetilcolina, por presentar un éster formado por el ácido trópico, tropanol y un grupo hidroxilo libre que gracias a estos se obtiene la actividad antimuscarínica especifica. Por lo que la atropina es el anticolinérgico más potente de uso in vivo, pero con una menor incidencia de bloqueo en los receptores nicotínicos, su mecanismo de acción bloquea de forma reversible las acciones colinomiméticas (unión a los receptores colinérgicos), impidiendo la acción de la acetilcolina sobre los receptores muscarínicos en el músculo liso disminuyendo las contracciones. Cuando la atropina se une al receptor muscarínico bloquea de forma competitiva a la acetilcolina e impide que esta despolarice la célula impidiendo el paso de Ca+2 por sus canales respectivos y por consiguiente también evita la liberación del trifosfato de inositol (IP3), disminuyendo la velocidad del tránsito intestinal.8, 11 y 37 A diferencia de la atropina, el N-butilbromuro de hioscina es un anticolinérgico derivado de amonio N cuaternario, que tiene mejor efecto antiespasmódico in vitro debido a su afinidad por los receptores nicotínicos. Según Galindo et al. este fármaco es usado específicamente como antiespasmódico que actúa bloqueando los receptores nicotínicos en ensayos in vitro, usado en condiciones espasmódicas viscerales, aliviando el dolor que genera la tensión 36 muscular, estos receptores nicotínicos presentan una rápida respuesta ya que ocurren cambios en su estructura por la apertura de un poro iónico selectivo para los cationes extracelulares, donde el receptor de la acetilcolina se encuentra en la sub unidad α1, lo cual permite el paso de iones de Na+ y Ca2+, causando una despolarización de la célula y seguidamente la contracción muscular, la hioscina no tiene efectos anticolinérgicos en el sistema nervioso central.11, 15 En cuanto a las concentraciones del extracto de tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra” lograron reducir la tensión del íleon, en comparación al control. Resaltando que la concentración de 2 mg/ml del extracto de tallos tiene mejor efecto de relajación que los fármacos estándares de atropina y N-butilbromuro de hioscina, logrando relajar el íleon hasta los 3,36 mm, asemejándose más al efecto de la hioscina (3,39 mm), las cuales son agrupadas en el grupo 1, según la prueba de Tukey demostrando que la respuesta de 2 mg/ml de tallos (3,36 mm) y hioscina 1x10- 3 (3,39 mm) presentan una semejante respuesta antiespasmódica. Según Kuri et al17, el género Cnidoscolus presenta compuestos fenólicos, las cuales son relacionados a mecanismos de relajación como la quercetina y los flavonoides. También cabe mencionar el estudio de Flores12, que en el año 2015 determinó el efecto antiespasmódico del extracto hidroalcohólico de las hojas de Chenopodium ambrosoides L. "paico" en íleon aislado de Cavia porcellus "cobayo". Determinando así que el extracto hidroalcohólico de las hojas de Chenopodium ambrosoides L. "paico" al 20% presenta mayor actividad antiespasmódica (altura de relajación 3,47 mm) semejante al de la atropina (respuesta de relajación 3,36 mm). La técnica in vitro que usó permitió sustentar la hipótesis sobre su uso tradicional. Según Lope15, en el año 2015 determinó el efecto antiespasmódico del extracto hidroalcohólico de las hojas del Solanum radicans L. "ñuqku" en Íleon aislado de cobayo, usó como inductor a la acetilcolina y como fármacos patrones N-butil bromuro de hioscina y atropina en comparación a las concentraciones de 10%, 15%, 20% y 30% del extracto hidroalcohólico de Solanum radicans L. "ñuqku", los resultados mostraron que Solanum radicans L. "ñuqku" tienen menor efecto antiespasmódico en comparación con la atropina (5,18 mm) y N-butilbromuro de hioscina (5,68 mm), siendo la concentración al 30% (6,16 mm) la de mayor efecto antiespasmódico semejante al de la atropina. Las concentraciones de 10%, 15% y 20% lograron disminuir la altura de la contracción a 7,56; 6,74 y 6,42 mm respectivamente. Las concentraciones de 1 37 mg/ml y 0,5 mg/ml del extracto de tallos presentan menor efecto de relajación en el íleon, por lo cual no fueron consideradas como un tratamiento óptimo. En la figura 8, se observa la variación de altura de las contracciones del íleon por efecto de la administración de cloruro sódico 0,9 %, acetilcolina 2x10-1 M, atropina 1x10-4 M, N-Butil bromuro de hioscina 1x10-3 M y las concentraciones de 2 mg/ml, 1 mg/ml y 0,5 mg/ml del extracto hidroalcohólico de hojas de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”. El íleon en estado normal presenta una altura promedio de 3,50 mm y que luego al inducirle contracciones con la acetilcolina 2x10-1 M, la altura se incrementa hasta 5,27 mm en promedio (Anexo 12), desde el minuto siete hasta el minuto trece, luego se inyectan los fármacos estándares atropina y hioscina (Anexo 13) relajando al íleon dos minutos después de inyectarlo, logrando reducirlos hasta los 3,56 y 3,39 mm respectivamente. En este grafico se demuestra que la concentración de 2 mg/ml del extracto de hojas logró relajar el íleon hasta los 3,38 mm, asemejándose al efecto de la hioscina (3,39 mm). La prueba de Tukey (Anexo 17), muestra que los tratamientos de 2 mg/ml del extracto de tallos, 2 mg/ml del extracto de hojas y N-butilbromuro de hioscina 1x10-3, presentan un semejante efecto farmacológico. En el tercer grupo se observa que agrupa a cuatro tratamientos, de las cuales se tomó en cuenta a 2 mg/ml del extracto de hojas (Anexo 14) y atropina 1x10-4, que lograron reducir la tensión hasta los 3,38 y 3,56 mm respectivamente, las cuales con la Prueba de Tukey se demuestra que presentan misma respuesta farmacológica. Sobre el subconjunto 4 y 5 no se tomaron en cuenta por presentar una mínima reducción de la tensión. Este efecto antiespasmódico generado por 2 mg/ml del extracto de tallos y 2 mg/ml del extracto de hojas, presentan posiblemente el mismo mecanismo de acción que la hioscina y la atropina, que son antagonistas de la acetilcolina, ya sea por la capacidad de antagonizar a los receptores muscarínicos o nicotínicos del íleon aislado. Estos resultados se asemejan a los resultados obtenidos por Flores12, donde demostró que la concentración al 20 % del extracto hidroalcohólico de las hojas de Chenopodium ambrosoides L. "paico" en íleon aislado de Cavia porcellus "cobayo" tiene efecto antiespasmódico, relajando al íleon tensionado con una altura de 8,42 mm hasta los 3,47 mm, semejante a la atropina (3,36 mm), y los extractos al 5% y 10% no fueron consideradas por presentar poca relajación muscular, logrando relajarlos hasta los 5,84 y 4,69 mm respectivamente. También se hace mención el estudio del extracto 38 hidroalcohólico de las hojas de Otholobium pubescens (Poir.) J.W. Grimes "wallwa" en íleon aislado de rata, realizado por Quilla8, donde demostró que la concentración al 30 % logra relajar al íleon hasta los 2,36 mm, similar al efecto de la atropina (2,14 mm), y las concentraciones de 15% y 20% no fueron consideradas por presentar en efecto antiespasmódico mínimo. Por tanto, se afirma que el extracto hidroalcohólico a 2 mg/ml de hojas (3,38 mm) y 2 mg/ml de tallos (3,36 mm) de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra” (Anexo 14), presentan un efecto antiespasmódico, debido a la relajación muscular que presenta el íleon, las cuales son semejantes al efecto de la hioscina (3,39 mm) y la atropina (3,56 mm), e incluso se puede notar que el tratamiento de 2 mg/ml del extracto de tallos tiene mayor efecto de relajación que ambos estándares. Estos resultados se usaron como datos primordiales para la prueba de Tukey (Anexo 16), se optó por esta prueba por su simplicidad, por disponer de límites de confianza y por ser exclusivamente un procedimiento que usa el diseño ANOVA (tratamientos con igual tamaño de muestra) y por incluir a las mejores medias de los tratamientos, separándolos por rangos en subconjuntos según sus medias.48 Se realizó el análisis de varianza ANOVA, para precisar si existe o no diferencia estadística significativa entre los diferentes tratamientos antiespasmódicos, comparando los fármacos patrones y las diferentes concentraciones de los extractos hidroalcohólicos de hojas y tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) Macbr. “huanarpo hembra”. Estos datos son obtenidos por el transductor que detecta o registra los diferentes movimientos físicos en señales eléctricas, las cuales son proporcionadas al amplificador y por consecuente son traducidas por el software LabChart del quimografo PanLab, creando así una base de datos. Adicionando a lo anterior, esta base de datos tiene relación con la tensión, puesto que la tensión muscular se mide con la amplitud (altura máxima) y el tiempo transcurrido, donde las alturas máximas presentadas por las contracciones musculares son de 5,27 mm en promedio (Figura 7 y 8). En la figura 9, se reafirma todo lo descrito anteriormente, tomando en cuenta el porcentaje de inhibición contráctil de los fármacos estándares y las concentraciones de los extractos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) Macbr. “huanarpo hembra” sobre íleon aislado de rata, observando que la concentración de 2 mg/ml del extracto de tallos logró una inhibición contráctil de 99,98 % mejor que los fármacos estándares de la hioscina 1x10-3 y la atropina 1x10-4, pero similar a la hioscina 39 (95,93%). La concentración de 2 mg/ml del extracto de hojas obtuvo un porcentaje de inhibición contráctil de 91,98% semejante a la hioscina (95,93%). Sin embargo, la atropina también logró una inhibición contráctil de 83,88%, la cual se relaciona con el efecto de 2 mg/ml del extracto de hojas. Las otras concentraciones menores no se tomaron en cuenta por obtener un mínimo de porcentaje de inhibición contráctil. Los resultados de este trabajo produjeron una inhibición contráctil dependiente de la concentración, se obtuvieron mediante los transductores isométricos, quienes captan el incremento y la disminución de la tensión muscular expresada en altura. La diferencia de respuestas porcentuales de inhibición contráctil entre los dos fármacos estándares son notables, el fármaco estándar N-butilbromuro de hioscina tiene un mayor efecto inhibitorio de 95,93 %, esto debido a que este fármaco trabaja en su mayoría con los receptores nicotínicos las cuales son usadas para un trabajo in vitro en especial, por lo que se resalta que la concentración de 2 mg/ml del extracto de hojas es similar al efecto de la hioscina, posiblemente por tener mayor afinidad hacia los receptores nicotínicos, ya que esta logra inhibir las contracciones hasta en un 91,98 % y que la concentración de 2 mg/ml del extracto de tallos tiene mejor efecto relajante que la atropina y la hioscina, donde se podría relacionar que el extracto de los tallos tiene mayor afinación hacia los receptores muscarínicos y nicotínicos, debido a su potencial de acción inhibitoria. La mayoría de los componentes identificados del extracto hidroalcohólico de los tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) Macbr. “huanarpo hembra” son los alcaloides, flavonoides, catequinas, fenoles y taninos. Estos extractos son semejantes a los estándares, lo cual se les podría considerar como uso alterno de la atropina y la hioscina, sin descartar que actúa sobre los receptores muscarínicos y nicotínicos. Los resultados expuestos son comprobados con lo expresado por Prado, que en el año 2013 realizó un trabajo de investigación sobre el efecto antiespasmódico del extracto hidroalcohólico de las hojas de Tanacetum parthenium (L.) Sch. Bip. "santa maría" en intestino de ratas Wistar. Usó como fármacos patrones la atropina, en la cual sus reportes de inhibición contráctil fueron 56,8%; 42,6% y 24,5% a concentraciones de 400, 200 y 100mg/kg del extracto hidroalcohólico de Tanacetum parthenium (L.) Sch. Bip. "santa maría" respectivamente, concluyendo que la concentración con mayor porcentaje de inhibición contráctil es de 56,8%. Siendo la dosis de 400 mg/kg el de mejor efecto antiespasmódico.14 Asimismo, Saavedra11 demostró que el extracto 40 hidroalcohólico del rizoma de Perezia coerulescens Wedd “mancharisqa” en íleon aislado de Cavia porcellus “cobayo”, al 16 % obtuvo un mejor efecto antiespasmódico, logrando un porcentaje de inhibición contráctil de 53,6 %, similar al efecto inhibitorio de la atropina (54,5 %), y las concentraciones de 4 y 8 % no fueron consideradas por obtener un bajo porcentaje de inhibición contráctil de 37.9 % y 51.4 %, respectivamente. De igual manera se considera el estudio del extracto hidroalcohólico de las hojas de Porophyllum ruderale (Jac.) cassini “rupay wachi” sobre íleon aislado de Cavia porcellus “cobayo”. Villavicencio, evaluó la inhibición contráctil del extracto a las concentraciones de 1%, 4% y 8% y usó como fármaco patrón la atropina. Se concluyo que el extracto al 8 % presenta mejor efecto antiespasmódico, logrando inhibir la motilidad a 12,76 % superior a los extractos de 1 y 4 %, que lograron obtener un porcentaje mínimo de 6,81 % y 9,46 % respectivamente. Cabe resaltar que el efecto inhibitorio de la atropina es de 24,33 %, esta fue superior a los extractos, sin embargo, el extracto al 8% se le considera similar al efecto de la atropina. Los resultados obtenidos demuestran positivamente la acción antiespasmódica del extracto hidroalcohólico de las hojas y tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”, actuando como antagonista competitivo de la acetilcolina, produciendo el mismo efecto que la atropina y N-butilbromuro de hioscina. Por ende, se afirma que el extracto hidroalcohólico de hojas y tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra” tienen efecto antiespasmódico sobre el íleon, las cuales podrían ser consideras como un uso alternativo para el tratamiento de los espasmos gastrointestinales. 41 VI. CONCLUSIONES 1. El extracto hidroalcohólico de las hojas y tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra” presentó efecto antiespasmódico en el íleon aislado de rata. 2. Los metabolitos secundarios identificados en el extracto hidroalcohólico de las hojas y tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra” fueron: flavonoides, alcaloides, azucares reductores, taninos, catequinas, lactonas, triterpenoides - esteroides, saponinas, fenoles, aminoácidos y resinas. 3. Los extractos hidroalcohólicos de 2 mg/ml del extracto de tallos y hojas de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra” presentaron mejor efecto antiespasmódico, con una inhibición contráctil de 99,98 % y 91,98%, respectivamente. 4. Los extractos hidroalcohólicos de 2 mg/ml de las hojas y tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”, respecto a la inhibición contráctil se aproximaron al efecto antiespasmódico de N- Butilbromuro de hioscina y atropina. 42 VII. RECOMENDACIONES 1. Seguir investigando sobre los otros efectos farmacológicos que puede presentar el extracto hidroalcohólico de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”. 2. Reconocer los metabolitos secundarios causantes del efecto antiespasmódico. 3. Completar el estudio de toxicidad del extracto hidroalcohólico de las hojas y tallos de Cnidoscolus diacanthus (Pax. & Hoffm.) macbr. “huanarpo hembra”. 4. Elaborar formulaciones farmacéuticas a partir del principio activo aislado. 43 VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Bustos Fernandez LM. Síndrome de intestino irritable: La importancia de los antiespasmódicos. Rev Colomb Gastroenterol. 2020; 35(3). [acceso 05 de agosto del 2022]; Disponible en: http://www.scielo.org.co/pdf/rcg/v35n3/0120- 9957-rcg-35-03-338.pdf 2. Borrero Robledo R. Efecto antiespasmódico comparativo de la Minthostachys Mollis "muña" y del N-butilbromuro de hioscina en intestino de cavia porcellus (cobayo). Tesis Doctoral. Universidad Catolica Los Angeles Chimbote, Ancash. 3. Encaje BE, Mearin F, Chang L, Chey WD, Lembo AJ, Simren M, et al. Trastornos intestinales. Gastroenterología. 2016; 150(6): p. 1393-1407. [acceso 20 de agosto del 2022]; Disponible en: https://www.sciencedirect.com/science/article /abs/pii 4. Villavicencio Araujo NY. 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