UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTÓBAL DE HUAMANGA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA Efecto antibacteriano del extracto hidroalcohólico de AYACUCHO – PERÚ 2023 PRESENTADO POR: Bach. GOMEZ PATIÑO, ROMARIO RONALDIÑO ASESOR: Dr. CÁRDENAS LÓPEZ, VÍCTOR LUIS CO-ASESORA: Dra. ANAYA GONZÁLEZ, ROBERTA BRITA la raíz de Hypseocharis bilobata killip frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. TESIS PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO, ESPECIALIDAD: MICROBIOLOGÍA iii A mis padres Reyna y Wilber, mis seres más queridos, que, con su amor y apoyo incondicional, me ayudaron a cumplir mis metas. v AGRADECIMIENTOS A mi querida casa de estudios, la Universidad Nacional de San Cristóbal de Huamanga, por permitirme adquirir y afianzar mis conocimientos y competencias profesionales. A la Facultad de Ciencias Biológicas y a la Escuela Profesional de Biología, por cobijarme bajo sus aulas y laboratorios. A la plana de docentes de la Escuela Profesional de Biología, quienes, con sus conocimientos y experiencias, guiaron el camino de mi formación académica y profesional. A mi asesor el Dr. Víctor Luis Cárdenas López y mi co-asesora la Dra. Roberta Brita Anaya González, ambos docentes de la Escuela Profesional de Biología de la UNSCH, por brindarme sus sabios consejos y su apoyo incondicional, durante la planificación, ejecución y presentación del presente trabajo de investigación. vii ÍNDICE GENERAL Pág. DEDICATORIA iii AGRADECIMIENTO v ÍNDICE GENERAL vii ÍNDICE DE TABLAS ix ÍNDICE DE FIGURAS xi ÍNDICE DE ANEXOS xiii RESUMEN xv I. INTRODUCCIÓN 1 II. MARCO TEÓRICO 3 2.1. Antecedentes 3 2.1.1. Internacional 3 2.1.2. Nacional 3 2.1.3. Local 5 2.2. Marco conceptual 5 2.2.1. Efecto antibacteriano 5 2.2.2. Extracto hidroalcohólico 5 2.2.3. Halo de inhibición 6 2.2.4. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) 6 2.2.5. Concentración Mínima Bactericida (CMB) 6 2.2.6. Antibióticos 6 2.2.7. Antimicrobiano 6 2.2.8. Cepas ATCC 6 2.3. Bases teóricas 6 2.3.1. Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” 6 2.3.2. Principios activos de plantas medicinales 8 2.3.3. Extracto vegetal 8 2.3.4. Efecto antibacteriano de compuestos de origen vegetal 8 2.3.5. Métodos de evaluación de la actividad antibacteriana de extractos vegetales 9 2.3.6. Streptococcus pyogenes 10 2.3.7. Eritromicina 11 III. MATERIALES Y METODOS 13 3.1. Lugar de ejecución 13 viii 3.2. Materiales 13 3.2.1. Muestra biológica 13 3.2.2. Microorganismo de ensayo 13 3.3. Metodología y recolección de datos 13 3.3.1. Preparación de la muestra 13 3.3.2. Obtención del extracto hidroalcohólico 14 3.3.3. Preparación de las concentraciones de extracto hidroalcohólico 14 3.3.4. Tamizaje fitoquímico 14 3.3.5. Determinación del efecto antibacteriano 14 3.3.6. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) 16 3.3.7. Determinación de la Concentración Mínima Bactericida (CMB) 16 3.4. Tipo de Investigación 16 3.5. Diseño de experimentación 16 3.6. Análisis estadístico 17 IV. RESULTADOS 19 V. DISCUSIÓN 25 VI. CONCLUSIONES 31 VII. RECOMENDACIONES 33 VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 35 ANEXOS 49 ix ÍNDICE DE TABLAS Pág. Tabla 1. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”, frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Ayacucho – 2022. 21 Tabla 2. Metabolitos secundarios presentes en el extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”. Ayacucho – 2022. 22 xi ÍNDICE DE FIGURAS Pág. Figura 1. Diámetro promedio de halos de inhibición formados a diferentes concentraciones de extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Ayacucho – 2022. 23 Figura 2. Porcentaje de inhibición de las diferentes concentraciones de extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Ayacucho – 2022. 24 xiii ÍNDICE DE ANEXOS Pág. Anexo 1. Ilustración y fotografía de la Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”. Ayacucho – 2022. 51 Anexo 2. Constancia de identificación taxonómica de la Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”. Ayacucho – 2022. 52 Anexo 3. Certificado de calidad de la cepa Streptococcus pyogenes ATCC 19615 enviado por Gen Lab S.A.C. – 2022. 53 Anexo 4. Cepa comercial de Streptococcus pyogenes ATCC 19615, enviado por Gen Lab S.A.C. – 2022. 54 Anexo 5. Cultivo joven de Streptococcus pyogenes ATCC 19615 en Agar sangre. Ayacucho – 2022. 55 Anexo 6. Protocolo de preparación del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”. Ayacucho – 2022. 56 Anexo 7. Preparación del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”. Ayacucho – 2022. 57 Anexo 8. Protocolo de determinación del efecto antibacteriano del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Ayacucho – 2022. 58 Anexo 9. Determinación del efecto antibacteriano del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Ayacucho – 2022. 59 Anexo 10. Halos de Inhibición formados por las distintas concentraciones de extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Ayacucho – 2022. 60 Anexo 11. Diámetro de halos de inhibición (mm), formados por las distintas concentraciones de extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Ayacucho – 2022. 61 Anexo 12. Porcentaje de Inhibición de las distintas concentraciones de extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip 62 xiv “pacha tara” frente a Streptoccocus pyogenes ATCC 19615. Ayacucho – 2022. Anexo 13. Prueba P de normalidad del diámetro de halos de inhibición, del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Ayacucho – 2022. 63 Anexo 14. Análisis de varianza (ANOVA), de halos de inhibición formados por los distintos tratamientos frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Ayacucho – 2022. 64 Anexo 15. Prueba de comparación múltiple t de Dunnet, de los halos de inhibición formados por los distintos tratamientos frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Ayacucho – 2022. 65 Anexo 16. Protocolo de determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”, frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Ayacucho – 2022. 66 Anexo 17. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Ayacucho – 2022. 67 Anexo 18. Proceso de tamizaje fitoquímico del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”. Ayacucho – 2022. 68 Anexo 19. Tamizaje fitoquímico del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”. Ayacucho – 2022. 69 Anexo 20. Matriz de consistencia. 70 xv RESUMEN El trabajo de investigación se realizó con el objetivo de evaluar y determinar in vitro, el efecto antibacteriano del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. El trabajo se desarrolló en los laboratorios de Bacteriología y Bioquímica de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de San Cristóbal de Huamanga, el tipo de investigación fue básica – experimental. El extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” se obtuvo por maceración y su efecto antibacteriano se evaluó por el método de Disco Difusión de Kirby – Bauer, a concentraciones de 10, 50, 100, 150 y 200 mg/ml, teniendo como control positivo a la eritromicina 15 𝜇𝑔 y como control negativo al agua destilada. La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración Mínima Bactericida (CMB) del mismo extracto, se determinó por el método de macrodilución en tubos y su respectivo subcultivo en placa. Para conocer la composición química del extracto, se realizó el tamizaje fitoquímico. La concentración de 200 mg/ml de extracto hidroalcohólico, presentó mayor efecto antibacteriano frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615, con un halo de inhibición promedio de 12,05 mm y un porcentaje de inhibición de 45,8% con respecto al control positivo. La CMI y la CMB, fue 6,25 mg/ml y 12,5 mg/ml respectivamente. Alcaloides, aminas, antocianidinas, azúcares reductores, glicósidos cardiotónicos, flavonoides, fenoles, taninos, lactonas, cumarinas, saponinas, triterpenos, esteroides y azúcares, fueron los metabolitos secundarios detectados en el extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”. Se concluye que el efecto antibacteriano del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615, depende de su concentración, pues a mayor concentración de extracto, mayor es el efecto antibacteriano generado. Palabras clave: Hypseocharis bilobata killip, efecto antibacteriano, extracto hidroalcohólico. 1 I. INTRODUCCIÓN Como se sabe el uso excesivo e indiscriminado de los antibióticos, ha generado en los gérmenes, la aparición de la resistencia antimicrobiana (Linares y Martínez, 2005). Esta situación actualmente constituye un problema de salud pública mundial, que; demanda el gasto de dinero y vidas, genera una creciente necesidad de nuevas drogas antimicrobianas y es la causa principal de la inefectividad de muchos tratamientos médicos. Ante esta situación, muchos investigadores y científicos, se han dispuesto a estudiar y encontrar nuevas sustancias antimicrobianas, a partir de plantas medicinales (Cordiés et al.,1998; Alvo et al., 2016). Las plantas medicinales constituidas como una fuente primordial de nuevas sustancias antimicrobianas, han sido empleadas desde la antigüedad para aliviar y tratar las distintas patologías del hombre, y esta situación no ha cambiado en los últimos tiempos (Zampini et al., 2007; Cáceres et al., 1998; Zampini et al., 2005). En la actualidad muchas plantas medicinales son empleadas de forma tradicional y empírica principalmente por la población rural para tratar distintas patologías infecciosas. Pero muchas de estas plantas no cuentan con el sustento científico que garantice y demuestre, la seguridad y efectividad de su uso (Soria, 2018; Hernández, 2005). Un claro ejemplo de ello es Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”, una planta medicinal altoandina que es empleada tradicionalmente por los pobladores rurales, para tratar y aliviar las dolencias y patologías infecciosas del sistema respiratorio superior (faringitis, faringoamigdalitis), muchas veces causadas por bacterias patógenas como el Streptococcus pyogenes. Las propiedades antibacterianas de esta planta, principalmente de su raíz, aún no han sido demostradas de forma experimental y solo existen indicios empíricos. En tal sentido en la presente investigación, se pretende demostrar de manera in vitro, el efecto antibacteriano del extracto hidroalcohólico de la raíz de 2 Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615, bajo los siguientes objetivos: Objetivo general Evaluar el efecto antibacteriano del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”, frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Objetivos Específicos 1. Determinar el efecto antibacteriano del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”, a diferentes concentraciones (10, 50, 100, 150 y 200 mg/ml) frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. 2. Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. 3. Determinar la Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. 4. Identificar de forma cualitativa los metabolitos secundarios presentes en el extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”. 3 II. MARCO TEÓRICO 2.1. Antecedentes 2.1.1. Internacional Dimas (2018), evaluó el efecto antibacteriano del extracto acético, hexánico y etanólico de la cáscara de Oxalis tuberosa en la vida anaquel de productos de panificación, a concentraciones de (1:2, 1:10, 1:50 y 1:100) por el método de Kirby – Bauer. Concluyó que el extracto etanólico de la cáscara de Oxalis tuberosa, presenta mayor efecto antibacteriano sobre bacterias Gram positivas y Gram negativas, deterioradoras del pan. Aguas (2019), al evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos acuosos de tubérculos andinos, como la “oca” (Oxalis tuberosa) y “mashua” (Tropaeolum tuberosum) frente a cepas bacterianas (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Enterococcus faecalis ATCC 29212), mediante la técnica de Kirby – Bauer, determinó que solo el extracto acuoso de tubérculos de la oca, presentan efecto antibacteriano frente a Escherichia coli ATCC 25922, con un halo de inhibición de 12 mm de diámetro. 2.1.2. Nacional Jaimes et al. (2020), al evaluar de manera in vitro, la actividad antibacteriana del extracto hidroalcohólico de Musa cavendishii L. “plátano morado” frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Streptococcus pyogenes ATCC 19615, a concentraciones de 10%, 25%, 50% y 75%, por el método de Kirby – Bauer, en diferentes tiempos de incubación (24, 48 y 72 horas), concluyeron que el extracto hidroalcohólico del plátano morado, presenta mayor efecto antibacteriano frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 al 75% y frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615 al 50%. Olortegui y Alvia (2021), evaluaron el efecto antibacteriano in vitro, del extracto hidroalcohólico del fruto de “cocona” (Solanum sessiliflorum) frente a 4 Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Streptococcus pyogenes ATCC 19615, por el método de Kirby – Bauer a concentraciones de 25%, 50% y 75%. Concluyeron que el extracto hidroalcohólico del fruto de cocona, presenta efecto antibacteriano frente a las cepas bacterianas. Moreno y Nuñez (2018), evaluaron el efecto antibacteriano del extracto hidroalcohólico de las flores de “manzanilla” (Matricaria chamomilla) frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615, in vitro. Prepararon diferentes concentraciones de extracto hidroalcohólico (10%, 30% y 50%) y evaluaron su actividad antibacteriana, utilizando el método de difusión en pozos. Observaron que la concentración de extracto hidroalcohólico con mayor efecto antibacteriano fue al 50%. Huarino (2011), realizó un trabajo de investigación para evaluar la actividad antibacteriana del extracto alcohólico de Caesalpinia spinosa “tara” sobre la flora (microbiota) salival mixta, a diferentes concentraciones ( 6,25 ; 12,5 ; 25 ; 50 y 75 mg/ml) por el método de difusión en agar (Kirby – Bauer). Observó que el diámetro del halo de inhibición, es mayor a medida que la concentración de extracto aumenta. Zavaleta et al. (2019), evaluaron la actividad antimicrobiana del extracto hidroalcohólico de hojas de Piper angustifolium “matico” a diferentes concentraciones (10, 15, 20, 25 y 30 mg/ml) sobre la cepa de Proteus mirabilis, emplearon para ello el método de Kirby – Bauer. Obteniendo el mayor halo de inhibición promedio (18,7 mm), a la mayor concentración de extracto hidroalcohólico (30 mg/ml). Concluyeron que el mayor efecto antimicrobiano se obtiene a la mayor concentración de extracto hidroalcohólico. Valladares y Soria (2021), evaluaron la actividad antibacteriana del extracto hidroalcohólico de los frutos maduros de “carambola” Averrhoa carambola L. frente a Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, mediante la técnica de Kirby – Bauer a concentraciones de 25, 50 y 100%. Determinaron que el extracto hidroalcohólico de la carambola, presenta actividad antibacteriana frente a Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, a concentraciones de 100 y 50 % con halos de inhibición promedio de 13,08 ± 0,43 y 9,82 ± 0,38 mm respectivamente. Benites (2017), evaluó el efecto antibacteriano in vitro del extracto etanólico de Piper aduncum “matico” sobre Streptococcus pyogenes grupo A, mediante el método de difusión en agar (Kirby – Bauer) a concentraciones de 5%, 25%, 50%, 75% y 100%, y determinó que el extracto etanólico del matico presenta efecto 5 antibacteriano frente a Streptococcus pyogenes grupo A, a concentraciones de 5, 25, 50, 75 y 100 % con halos de inhibición promedio de 41,83; 44,33; 41,33; 42,33 y 48,50 mm respectivamente. Coronado y Cauna (2018) , evaluaron la actividad antibacteriana de extractos hidroalcohólicos de Plantago major “llantén” y Rumex crispus “lengua de vaca” sobre cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Escherichia coli ATCC 25922 y Pseudomona aeruginosa ATCC 15442, a concentraciones de 0,1%; 0,2%; 0,5%; 1%; 2,5% y 5 % ,mediante el método de Kirby – Bauer. También determinaron la CMI y CMB del extracto hidroalcohólico de ambas plantas, mediante el método de dilución en placa. Sus resultados muestran que el extracto hidroalcohólico de Plantago major “llantén” tuvo actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Escherichia coli ATCC 25922 y Pseudomona aeruginosa ATCC 15442 a concentraciones de 1; 2,5 y 5% y el extracto hidroalcohólico de Rumex crispus “lengua de vaca” a concentraciones de 0,2; 0,5; 1; 2,5 y 5 %. La CMI y la CMB del extracto hidroalcohólico de Plantago major fue 0,2 mg/ml y 0,5 mg/ml respectivamente, mientras que para el extracto hidroalcohólico de Rumex crispus fue 0,1 mg/ml y 0,2 mg/ml. 2.1.3. Local Huashuayo (2016), evaluó la actividad antibacteriana de los extractos acuoso y etanólico de las vainas y semillas de Caesalpinia spinosa “tara” frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615 a concentraciones de (500, 400, 300, 200 y 100 mg/ml) mediante el método de difusión de pozos en agar y determinó la CMI y la CMB por el método de dilución en caldo. Los resultados que obtuvo, muestran que el extracto acuoso de vainas presentó mayor efecto antibacteriano, a una concentración de 500 mg/ml con un halo de inhibición promedio de 15,7 mm de diámetro. La CMI y la CMB fue 1,95 mg/ml y 3,90 mg/ml respectivamente. 2.2. Marco conceptual 2.2.1. Efecto antibacteriano Es la capacidad que posee una sustancia de inhibir el crecimiento o proliferación de bacterias (Sumathi y Parvthi, 2011). 2.2.2. Extracto hidroalcohólico Extracto vegetal que se obtiene a través de un proceso de extracción sólido - líquido, en la cual la materia vegetal seca (triturada) se pone en contacto con una disolución de alcohol en agua (Tituaña, 2013). 6 2.2.3. Halo de inhibición Es aquella zona clara que se forma alrededor de un disco de antibiótico, en el que no hay crecimiento microbiano (Zurita, 2013). 2.2.4. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) Es la concentración más baja de un antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento visible de un microorganismo al cabo de un periodo de incubación (Sacsaquispe y Velásquez, 2002). 2.2.5. Concentración Mínima Bactericida (CMB) Es la concentración más baja de un antimicrobiano capaz de eliminar al 99,9% de microorganismos al cabo un periodo de incubación (Horna et al., 2005). 2.2.6. Antibióticos Sub grupo de antimicrobianos producidos por organismos vivos, que a bajas concentraciones presentan actividad antibacteriana (Seija y Vignoli, 2006). 2.2.7. Antimicrobiano Sustancia química de origen natural, sintética o semisintética que presenta actividad antimicrobiana (Paredes y Roca, 2004). 2.2.8. Cepas ATCC Son cepas de referencia, recomendadas por el CLSI (Clinical an Laboratory Standars Institute) para ser utilizadas en pruebas de susceptibilidad antimicrobiana (Araya et al., 2015). 2.3. Bases teóricas 2.3.1. Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” a) Características botánicas La Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”, es una planta herbácea perenne, arrosetada, hemicriptófita y acaule vivaz, que crece de forma silvestre a ras del suelo, con un tamaño promedio de 6 a 20 cm y una cobertura de 16 cm de diámetro. Presenta hojas basales numerosas, compuestas, imparipinnadas, penninervias y con nerviación poco marcada. Con peciolo, peciolulo, raquis y foliolo. Raíz pivotante primaria que crece y se convierte en una sola raíz bulbosa - fibrosa, de forma cónica, el cual representa el 70% en volumen y el 75% en peso con respecto a toda la planta. Flor simple terminal, completa, muy vistosa de color blanco, actinomorfa, heteroclamídea, estrobiloidea, hipógina, con 15 estambres, con antera formada por dos tecas del mismo tamaño y con un pistilo de ovario súpero pubescente pluricarpelar, que se une a la planta por un pedúnculo floral de aproximadamente 6 cm. Fruto capsular con semillas negras acorazonadas de 2 7 mm de longitud. Crece hasta la fase de amacollamiento, donde las hojas se secan y queda la raíz subterránea con yemas de renuevo (Romero, 1994; Romero y De La Cruz, 1997; Lozada et al., 2020).(Anexo 1). b) Taxonomía La especie vegetal utilizada en el presente trabajo de investigación, se ubica en la siguiente categoría taxonómica (Anexo 2): División : Magnoliophyta Clase : Magnoliopsida Sub clase : Rosidae Orden : Geraniales Familia : Oxalidaceae Género : Hypseocharis Especie : Hypseocharis bilobata killip N.V. : “pacha tara” c) Distribución geográfica y hábitat El género Hypseocharis es endémico de los andes, crece a alturas que oscilan entre los 2000 a 4200 msnm en ambientes de prepuna y puna. Su presencia se extiende desde el norte del Perú “Región Ancash” hasta el noroeste de Argentina “Provincia La Rioja”. En el Perú se distribuye en las regiones de Ayacucho, Cuzco, Junín, La Libertad, Huancavelica y Ancash, desde los 3200 a 3800 msnm (Romero, 1994; Slanis y Grau, 2001; Organismo Andino de Salud – Convenio Hipólito Unanue, 2014; Rodríguez et al., 2019; Lozada et al., 2020). El género Hypseocharis presenta aproximadamente 9 especies, las cuales por lo general se encuentran en hábitat abiertos, en suelos poco profundos, en pastizales andinos y entre las rocas (Slanis y Grau, 2001; Lozada et al., 2020). La especie Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” es una planta altoandina que crece asociada a plantas cespitosas, en ambientes con mayor humedad, a orillas de los ríos, en pastizales de neblina y ambientes de prepuna y puna, desde los 3500 a 3800 msnm. En el Perú su presencia se ha reportado en los departamentos de Ayacucho, Huancavelica, Cuzco, Junín y La Libertad (Romero, 1994; Organismo Andino de Salud – Convenio Hipólito Unanue, 2014). d) Usos La raíz de la Hypseocharis ha sido utilizada desde la antigüedad por la población andina, pues existen evidencias que plantean la posibilidad de haber sido utilizada como alimento a comienzos del Pleistoceno. Actualmente la Hypseocharis es 8 utilizada por la población andina, como planta medicinal y como alimento de emergencia (Slanis y Grau, 2001). e) Importancia medicinal La Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”, es utilizada tradicionalmente por los pobladores alto andinos para tratar el dolor de estómago, cáncer, fracturas, golpes, heridas, inflamación de la matriz (Organismo Andino de Salud – Convenio Hipólito Unanue, 2014), gastritis y afecciones de las amígdalas y faringe .Tiene propiedad antiespasmódica, antitusiva, cicatrizante de heridas, antiulcerosa, antioxidante, alivia úlceras y gastritis (Romero, 1994; De La Cruz et al., 2006 ; Palomino, 2013; Ayala, 2011). 2.3.2. Principios activos de plantas medicinales Principio activo es aquella molécula producto del metabolismo vegetal, que posee actividad farmacológica, biológica y tóxica (Berdonces, 1994; OPS, 2019). El estudio de sus propiedades farmacológicas y terapéuticas, implica aislarlo, probarlo, y determinar mediante técnicas fitoquímicas, estudios pre-clínicos y/o clínicos su eficiencia y seguridad (Valenzuela, 2019; Soria, 2018; OPS, 2019). Para lograr una concentración adecuada de los principios activos, es necesario realizar diversos procedimientos de extracción con solventes adecuados, de acuerdo a la solubilidad y estabilidad de las sustancias benéficas (Miranda y Cuellar, 2013). 2.3.3. Extracto vegetal Los extractos vegetales son mezclas concentradas de metabolitos secundarios o fitocomplejos con distintas propiedades farmacológicas. Presentan una consistencia sólida, líquida o semisólida y se obtienen a través de un proceso de extracción adecuada y con diferentes solventes (OPS, 2019; Carrión y García, 2010; García et al., 2010; Aguilar et al., 2020). 2.3.4. Efecto antibacteriano de compuestos de origen vegetal Muchos de los compuestos químicos presentes en las plantas, poseen actividad antimicrobiana, antibacteriana, antifúngica e incluso antiviral (Martínez, 2020; Domingo y López, 2003) , con un espectro de acción biológica muy variada (Mussel, 1983), y los estudios de laboratorio así lo demuestran. Se encuentran en tallos, frutos, hojas, flores y muchos de ellas son producidas en respuesta a la infección por fitopatógenos, como las fitoalexinas ( Charles y Samir, 2000; García y Pérez, 2003). 9 El efecto antibacteriano es la capacidad que posee una sustancia de inhibir el crecimiento o proliferación de bacterias (Sumathi y Parvthi, 2011). 2.3.5. Métodos de evaluación de la actividad antibacteriana de extractos vegetales No hay una reglamentación o una estandarización de la metodología para evaluar la capacidad inhibitoria de extractos vegetales. Es así que diferentes métodos pueden ser usados para determinar y evaluar de manera in vitro, la resistencia y susceptibilidad de bacterias a agentes antimicrobianos naturales. Los métodos más utilizados en el laboratorio por su sencillez y rapidez, son; los métodos de difusión y los métodos de dilución (Shiva, 2007; Ramirez y Castaño, 2009). a) Método de Disco difusión en placa (Kirby – Bauer) El método de disco difusión en placa, es una técnica basada en el trabajo de Kirby – Bauer y colaboradores , el cual nos permite determinar de forma cualitativa e in vitro, la sensibilidad bacteriana frente a los antimicrobianos (SEIMC, 2000; Shiva, 2007; Ramirez y Castaño, 2009; Sacsaquispe y Velásquez, 2002; Zurita, 2013). Es utilizada con mayor frecuencia para evaluar la actividad antibacteriana de extractos vegetales (Medina, 2015), y es recomendada por El National Committte for Clinical Laboratory Standars (NCCLS) en el campo clínico (SEIMC, 2000). Este método consiste en depositar en la superficie de agar de una placa Petri previamente inoculada con un microorganismo, discos de papel secante impregnados con una concentración conocida de antibiótico y/o sustancia en estudio. El antibiótico y/o sustancia en estudio al entrar en contacto con la superficie húmeda del agar, se difunde radialmente y al cabo de un determinado tiempo de incubación, forma una zona de inhibición que permite determinar y comparar los efectos del antibiótico y/o sustancia en estudio, sobre el microorganismo estudiado (SEIMC, 2000; Ramirez y Castaño, 2009; Shiva, 2007). b) Método de macrodilución Es un método cuantitativo que nos permite determinar de manera in vitro la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración Mínima Bactericida (CMB) de un antimicrobiano o sustancia en estudio (extracto vegetal) (SEIMC, 2000; Medina, 2015; Wilkinson, 2006). Este método consiste en preparar una batería de tubos con caldo, a los cuales se les agrega el antibiótico o la sustancia en estudio, en distintas concentraciones. Luego se inoculan cada uno de los tubos, una suspensión estandarizada del microorganismo en estudio y tras un periodo de incubación se determina la 10 concentración mínima inhibitoria (CMI)(SEIMC, 2000; Wilkinson, 2006; Servicio de Antimicrobianos - INEI -ANLIS, 2012). 2.3.6. Streptococcus pyogenes a) Características generales Es una bacteria patógena, anaerobio facultativo, con forma de coco, Gram positivo que se dispone en cadenas largas o cortas. Pertenece al grupo A de la clasificación de Lancefield, es bacitracina sensible, catalasa y oxidasa negativos. Se desarrolla óptimamente en medios enriquecidos como el Agar Sangre, donde forma colonias circulares , convexas, blancas, grises, mucoides o translúcidas, de borde entero y  - hemolíticas (Castro, 2014; Lopardo et al., 2016; Chávez et al., 2013; Murray et al., 2009; Brooks et al., 2011; García et al., 2020; Ryan et al., 2011; Trabulsi et al., 2015; Llop et al., 2001; Martínez, 2016; Arredondo y Villicaña, 2007; Díez et al., 2006). b) Patogenicidad Streptococcus pyogenes, también conocido como “bacteria comedora de carne” o etimológicamente como “baya flexible productora de pus”, es un patógeno humano que presenta un conjunto de factores de virulencia (proteína M, proteína F, proteínas M-like, ácido lipoteicoico, cápsula, enzimas y toxinas), que le permiten infectar células humanas, diseminarse, burlar la defensa inmunitaria, sobre- estimular la respuesta inmunológica y generar enfermedades supurativas ( faringitis, faringoamigdalitis, escarlatina, infecciones de la piel, sepsis, bacteriemia , SSTE, neumonía, fascitis necrosante,etc) y no supurativas ( fiebre reumática y glomerulonefritis aguda) (Murray et al., 2009; Brooks et al., 2011; Castro, 2014; Ryan et al., 2011; Martínez, 2016; Harvey et al., 2008; Basualdo et al., 2006). c) Importancia clínica Streptococcus pyogenes es una bacteria patógena que coloniza piel o garganta y es responsable de una amplia gama de enfermedades que van desde una invasión local o sistémica, hasta trastornos inmunitarios pos-estreptocócicos. Su reservorio natural son la piel y las membranas mucosas de pacientes enfermos, convalecientes o portadores asintomáticos, desde los cuales se disemina por contacto directo de persona a persona, a través de gotas de secreciones respiratorias o por la piel. Muchas de las enfermedades producidas por Streptococcus pyogenes, son fatales si no se da una intervención médica adecuada, pero actualmente debido a la presencia de antibióticos, las complicaciones son muy raras. La mayoría de infecciones producidas por 11 Streptococcus pyogenes, son tratadas con antibióticos como la penicilina y macrólidos (Lopardo et al., 2016; Murray et al., 2009; Brooks et al., 2011; Castro, 2014; Llop et al., 2001; Trabulsi et al., 2015; Martínez, 2016; Harvey et al., 2008). Streptococcus pyogenes sigue siendo sensible a la penicilina, pero con respecto a los macrólidos como la eritromicina, se han reportado casos de resistencia antimicrobiana en países como Japón y Finlandia (Lopardo et al., 2016; Brooks et al., 2011; Trabulsi et al., 2015; Tulio et al., 2005). Aunque la frecuencia de reporte de casos de resistencia antimicrobiana de Streptococcus pyogenes sea mínima, no deja de ser una preocupación a futuro. 2.3.7. Eritromicina Antibiótico utilizado para el tratamiento de infecciones bacterianas como faringitis, fiebre escarlatina, neumonía, septicemia, otitis media, erisipela, otitis supurativa, etc. Actúa sobre bacterias Gram positivas, actinomicetos, treponemas, micoplasmas, clamidias, rickettsias y algunas Gram negativas, inhibiendo la síntesis de proteínas (Álvarez y García, 2002). 13 III. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Lugar de ejecución El trabajo de investigación se realizó en los Laboratorios de Bacteriología y Bioquímica de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de San Cristóbal de Huamanga, durante los meses de enero a marzo de 2022. 3.2. Materiales 3.2.1. Muestra biológica Tres kilogramos de raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”, recolectadas por conveniencia del Centro Poblado de San Juan de Chito, del distrito y provincia de Vilcas Huamán región Ayacucho. Las raíces recolectadas cumplieron con los criterios de selección: ser raíces sanas, robustas, grandes, completas y principales. 3.2.2. Microorganismo de ensayo Streptococcus pyogenes ATCC 19615, adquirido del Laboratorio Comercial Microbiologics a través de Gen Lab del Perú S.A.C. (Anexo 4). 3.3. Metodología y recolección de datos 3.3.1. Preparación de la muestra Las raíces de la Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”, recolectadas y seleccionadas previamente, fueron sometidas a un proceso de limpieza, desinfección y corte. Luego estas se secaron a temperatura ambiente en el Laboratorio de Bioquímica, sobre cartulina blanca aproximadamente por 1 semana. Posteriormente para eliminar aún más la humedad, las raíces fueron sometidas a un proceso de post-secado a 40°C por 24 horas. Finalmente se procedió a la molienda, con un molino manual de granos hasta obtener un polvo seco (Palomino, 2013). 14 3.3.2. Obtención del extracto hidroalcohólico Se colocó 500 g del polvo seco más 3 L de etanol al 80% en un frasco de color ambar y se dejó macerar por 1 semana, durante el proceso se agitó el frasco periódicamente (Palomino, 2013). Pasado el tiempo de maceración, se procedió a filtrar la solución resultante y luego se concentró en la estufa a 40 °C, hasta obtener un extracto seco, el cual se almacenó en frasco ambar y en refrigeración hasta su uso (Huashuayo, 2016). 3.3.3. Preparación de las concentraciones de extracto hidroalcohólico Se pesó 2 g de muestra del extracto hidroalcohólico y se colocó en una fiola de 10 ml, luego se enrasó con agua destilada estéril y se agitó hasta obtener una solución homogénea. A partir de esta solución que tiene 200 mg/ml de concentración de extracto hidroalcohólico, se realizó las diluciones correspondientes para obtener concentraciones de 10, 50, 100 y 150 mg/ml (Guzmán, 2014). 3.3.4. Tamizaje fitoquímico Para la identificación de metabolitos secundarios presentes en el extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”, se realizó las pruebas de Dragendorf, Mayer, Wagner, Ninhidrina, antocianidinas, Benedict, Kedde, Shinoda, Cloruro Férrico, Baljet, Borntrager, Resina, Espuma, Lierberman- Burchard, Molish e Hidroxamato férrico (Miranda y Cuellar, 2000).(Anexo 19). 3.3.5. Determinación del efecto antibacteriano El efecto antibacteriano del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”, se determinó mediante la técnica de disco difusión de Kirby-Bauer. La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración Mínima Bactericida (CMB), se determinó por el método de las diluciones sucesivas en tubo (Macrodilución) y su respectivo subcultivo en placa (SEIMC, 2000; Huamaní, 2021).(Anexos 8 y 16). a) Preparación de medios de cultivo Agar sangre Se preparó el Agar Base Columbia de acuerdo a las indicaciones del fabricante, se esterilizó y se dejó enfriar en baño de agua hasta que alcance los 45 °C, luego se añadió 5% de sangre de carnero desfibrinada. A continuación, se plaqueó en placas estériles teniendo en cuenta que el grosor del agar fuese aproximadamente 4 mm, y finalmente se dejó solidificar. 15 Agar Mueller Hinton enriquecido con 5% de sangre Se preparó el Agar Mueller Hinton de acuerdo a las indicaciones del fabricante, se esterilizó y se dejó enfriar en baño de agua hasta que alcance los 45 °C, luego se añadió 5% de sangre de carnero desfibrinada. A continuación, se plaqueó en placas estériles teniendo en cuenta que el grosor del agar fuese aproximadamente 4 mm, y finalmente se dejó solidificar (Llantoy, 2013). b) Activación de la cepa bacteriana Se sembró por estrías la cepa de Streptococcus pyogenes ATCC 19615 en Agar Sangre previamente plaqueada, luego se incubó a 37 °C por 18 horas en condiciones de anaerobiosis, para obtener un cultivo joven (Sacsaquispe y Velásquez, 2002). c) Preparación del inóculo bacteriano Se procedió a coger varias colonias del cultivo joven y se transfirió a un tubo que contenía solución salina fisiológica 0,9%, hasta obtener una turbidez equivalente a 0,5 de la escala de Mc. Farland (SEIMC, 2000). d) Preparación del cultivo bacteriano Con la ayuda de un hisopo estéril, se procedió a sembrar el inóculo bacteriano, en placas que contenían Agar Mueller Hinton enriquecido con 5% de sangre de carnero, en diferentes direcciones (horizontal, vertical, diagonal, y circular alrededor del perímetro del medio de cultivo) (SEIMC, 2000). e) Incorporación de discos Se impregnaron discos de papel Whatman, de 6 mm de diámetro, con las diferentes concentraciones de extracto hidroalcohólico (10 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml 150 mg/ml y 200 mg/ml), luego se depositaron sobre la superficie del Agar Mueller Hinton enriquecido con 5% de sangre de carnero, previamente sembrado con Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Las placas se incubaron a 37 °C por 24 horas, en condiciones de anaerobiosis. También se depositó un disco de eritromicina 15 𝜇𝑔 como control positivo y un disco de papel Whatman con agua destilada estéril como control negativo (SEIMC, 2000; Guzmán, 2014; Sacsaquispe y Velásquez, 2002). f) Lectura de los halos de inhibición Pasado el tiempo de incubación, se examinó cada placa y se procedió a medir el diámetro de los halos de inhibición formados alrededor de cada disco, empleando para ello un vernier (SEIMC, 2000). 16 g) Cálculo del porcentaje de inhibición Una vez obtenidas las medidas del diámetro de cada uno de los halos de inhibición, se procedió a calcular el porcentaje de inhibición para cada concentración de extracto, utilizando la siguiente fórmula (Llantoy, 2013): % de Inhibición = Diámetro del halo de inhibición de la muestra Diámetro del halo de inhibición del control positivo × 100 3.3.6. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) Se preparó 15 tubos de ensayo, estériles y se rotuló de 1 al 15. A continuación se agregó a todos los tubos, 1ml de Caldo Mueller Hinton enriquecido con 5% de sangre de carnero desfibrinada. Luego se agregó 1ml de extracto hidroalcohólico (200 mg/ml) al tubo N° 1, a partir del cual se traspasó 1 ml al tubo N° 2 y así sucesivamente hasta el tubo N° 14, del cual se tomó 1 ml y se descartó. El tubo N° 15 no recibió el extracto, siendo este el control positivo. Finalmente se agregó 1 ml de inóculo bacteriano (turbidez equivalente a 0,5 de la escala de Mc Farland) a todos los tubos y se llevó a incubación a 37° C por 18 horas en condiciones de anaerobiosis (Huashuayo, 2016; Sacsaquispe y Velásquez, 2002; SEIMC, 2000). La CMI se determinó por subcultivo de resultados en Agar Sangre (Huarancca, 2016) (Anexo 16). 3.3.7. Determinación de la Concentración Mínima Bactericida (CMB) La CMB se determinó a partir de CMI de la siguiente manera: Se seleccionó 5 tubos consecutivos de la CMI (3 tubos con caldo transparente y 2 tubos con caldo turbio), luego se procedió a sembrar por estrías una asada de cada tubo en una placa de Agar Sangre. Posteriormente se incubó cada placa a 37 °C por 24 horas en condiciones de anaerobiosis. Pasado el tiempo de incubación se observó el crecimiento de las colonias en cada placa y se consideró como la Concentración Mínima Bactericida (CMB), la concentración correspondiente a la placa donde no hubo crecimiento bacteriano (Guzmán, 2014; Huashuayo, 2016; Laynes, 2020).(Anexo 16) 3.4. Tipo de Investigación Básica – Experimental 3.5. Diseño de experimentación Se desarrolló un diseño experimental completamente aleatorio (DCA), con siete tratamientos y cuatro repeticiones. 17 N° de repetición Tratamientos T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 1 2 3 4 Donde: T1: Disco de papel Whatman con 10 mg/ml de extracto hidroalcohólico. T2: Disco de papel Whatman con 50 mg/ml de extracto hidroalcohólico. T3: Disco de papel Whatman con 100 mg/ml de extracto hidroalcohólico. T4: Disco de papel Whatman con 150 mg/ml de extracto hidroalcohólico. T5: Disco de papel Whatman con 200 mg/ml de extracto hidroalcohólico. T6: Disco de papel Whatman con 15 𝜇𝑔 de eritromicina, como control positivo. T7: Disco de papel Whatman con agua destilada estéril, como control negativo. 3.6. Análisis estadístico Los resultados obtenidos de la medida de los halos de inhibición, fueron sometidos a una prueba de análisis de varianza (ANOVA), para probar la diferencia entre tratamientos. También se aplicó la prueba de comparación múltiple de t de Dunnet, para probar la diferencia de medias de los halos de inhibición a un nivel de confianza del 95%, utilizando del paquete estadístico SPSS versión 26. 19 IV. RESULTADOS 21 Figura 1. Diámetro promedio de halos de inhibición formados a diferentes concentraciones de extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Ayacucho – 2022. 7.31 9.50 10.45 11.55 12.05 26.30 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 10 mg/ml extracto 50 mg/ml extracto 100 mg/ml extracto 150 mg/ml extracto 200 mg/ml extracto 15 ug de eritromicina D iá m e tr o p ro m e d io d e h a lo d e i n h ib ic ió n (m m ) Tratamiento 22 Figura 2. Porcentaje de inhibición de las diferentes concentraciones de extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Ayacucho – 2022. 27,8 36,1 39,7 43,9 45,8 100 0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 10 mg/ml extracto 50 mg/ml extracto 100 mg/ml extracto 150 mg/ml extracto 200 mg/ml extracto 15 ug de Eritromicina P o rc e n ta je d e I n h ib ic ió n ( % ) Tratamiento 23 Tabla 1. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”, frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Ayacucho – 2022. N° de tubo Concentración de extracto (mg/ml) Observación 1 100 - 2 50 - 3 25 - 4 12,5 - (CMB) 5 6,25 + (CMI) 6 3,13 + 7 1,56 + 8 0,78 + 9 0,39 + 10 0,20 + 11 0,10 + 12 0,05 + 13 0,02 + 14 0,01 + 15 0 + Leyenda - : Ausencia de crecimiento bacteriano + : Presencia de crecimiento bacteriano CMI : Concentración Mínima Inhibitoria CMB : Concentración Mínima Bactericida 24 Tabla 2. Metabolitos secundarios presentes en el extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”. Ayacucho – 2022. Ensayo Metabolito secundario identificado Resultado Observación Dragendorff Alcaloides +++ Precipitado marrón Mayer ++ Turbidez Wagner ++ Turbidez Ninhidrina Aminas + Coloración Azul Violáceo Antocianidinas Antocianidinas ++ Coloración marrón rojiza en fase amílica Benedict Azúcares reductores +++ Precipitado rojo ladrillo Kedde Glicósidos cardiotónicos ++ Coloración violáceo Shinoda Flavonoides +++ Coloración rojo cereza en fase amílica Cloruro férrico Fenoles y/o taninos +++ Coloración azul, verde Baljet Lactonas y/o cumarinas ++ Coloración rojiza Borntrager Quinonas - Ausencia de coloración rojiza en fase amoniacal Resinas Resinas - Ausencia de precipitado Espuma Saponinas ++ Espuma con altura mayor a 2 mm Liebermann - Burchard Triterpenos y/o esteroides ++ Coloración rosada Molish Azúcares ++ Presencia de anillo violáceo Hidroxamato férrico Cumarinas ++ Coloración violeta intenso Leyenda + : Escaso ++ : Regular +++ : Abundante - : Negativo 25 V. DISCUSIÓN En la figura 1, se muestra los resultados de la evaluación del efecto antibacteriano, de distintas concentraciones de extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. En él se observa que: todas las concentraciones de extracto hidroalcohólico trabajados (10mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml y 200 mg/ml) presentan efecto antibacteriano frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615 , la concentración de 200 mg/ml de extracto hidroalcohólico generó mayor efecto antibacteriano después del control positivo con un halo de inhibición promedio de 12,05 mm , la concentración de 10 mg/ml de extracto hidroalcohólico, generó menor efecto antibacteriano con un halo de inhibición promedio de 7,31 mm y el control positivo (15 𝜇𝑔 de eritromicina), generó un halo de inhibición promedio de 26,30 mm, siendo este el mayor de todos. Los resultados obtenidos podrían deberse a que el efecto antibacteriano del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”, está relacionado directamente con su concentración, pues a mayor concentración de extracto, mayor es la concentración de principios activos y mayor es el efecto antibacteriano generado. Al respecto muchos trabajos de investigación relacionados con la evaluación del efecto antibacteriano de extracto vegetales frente a microorganismos patógenos, llegaron a la conclusión de que el efecto antibacteriano (porcentaje de inhibición y diámetro promedio de halos de inhibición) de un extracto vegetal, es proporcional a la concentración de los mismos (Bautista, 2009; Huamaní, 2021; Laynes, 2020; Guzmán, 2014; Avilés et al., 2018; Guillén y Chavez de Rebisso, 2011; Castro, 2017; Maquera, 2019; Martínez et al., 2012; Cholán et al., 2019). Este principio puede ser explicado muy bien por el método de disco difusión de Kirby – Bauer, pues si la concentración inicial de un extracto vegetal, principio activo o antibiótico en el disco de papel es 26 mayor, entonces el extracto, principio activo o antibiótico se difundirá más, abarcando mayor área y generando mayor halo de inhibición (SEIMC, 2000; Ramirez y Castaño, 2009). Pero, hay que tener en cuenta que otros factores como; el medio de cultivo empleado, capacidad de difusión del compuesto, tiempo de generación del microorganismo, cantidad de inóculo, sensibilidad al antibiótico y el periodo de incubación, también van a influir en la formación y tamaño del halo de inhibición (Ramirez y Castaño, 2009). También debemos recordar que cuando se trabaja con material vegetal, la existencia de un halo de inhibición por más pequeña que sea, nos indica cierta actividad antibacteriana (Palomino, 2000). La prueba de análisis de varianza ANOVA (Anexo 14) con un nivel de confianza del 95%, nos demuestra que existe diferencia en el efecto de los tratamientos (p < 0,05) y la prueba de comparaciones múltiples t de Dunnett (Anexo 15) nos demuestra que el efecto antibacteriano generado por las distintas concentraciones de extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” (10 mg/ml; 50 mg/ml; 100 mg/ml ; 150 mg/ml y 200 mg/ml de extracto), no superan el efecto antibacteriano del control positivo (15 𝜇𝑔 de eritromicina). Al respecto, es de esperarse que el control positivo (15 𝜇𝑔 de eritromicina), presente un efecto antibacteriano superior al efecto generado por el extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”, pues es un fármaco estandarizado, purificado, probado y con espectro de acción definida (Idris et al., 2009; SEIMC, 2000; Sacsaquispe y Velásquez, 2002). Por otro lado, el extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”, presenta un conjunto de metabolitos secundarios que repotencian o disminuyen su efecto antibacteriano (Lock de Ugaz, 1994). Según OPS (2019) y Chang et al. (2013) los metabolitos secundarios presentes en un extracto vegetal pueden actuar de manera individual, sinérgica o antagónica. Muchos trabajos de investigación orientados a la evaluación del efecto antibacteriano de extracto vegetales, utilizaron fármacos estándares como control positivo y observaron que este es el que genera el mayor efecto antibacteriano (Bautista, 2009; Huashuayo, 2016; Huamaní, 2021; Laynes, 2020; Avilés et al., 2018; Guillén y Chavez de Rebisso, 2011; Martínez et al., 2012). Al respecto nuestros resultados cumplen con esta condición. En la figura 2, se muestra el porcentaje de inhibición de las distintas concentraciones de extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” frente al Streptococcus pyogenes ATCC 19615. En él se observa 27 que: todas las concentraciones de extracto hidroalcohólico trabajadas (10 mg/ml; 50 mg/ml; 100 mg/ml; 150 mg/ml y 200 mg/ml) presentan porcentajes de inhibición menores al 50 % con respecto al control positivo (15 𝜇𝑔 de eritromicina), la concentración de 200 mg/ml de extracto hidroalcohólico generó el mayor porcentaje de inhibición (45,8%) con respecto al control positivo y la concentración de 10 mg/ml de extracto hidroalcohólico, generó menor porcentaje de inhibición (27,8 %). El porcentaje de inhibición del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”, está relacionado directamente con su concentración, pues a mayor concentración de extracto, mayor es el porcentaje de inhibición. Al respecto muchos trabajos de investigación relacionados con el tema, concluyeron que un extracto vegetal a su mayor concentración, genera mayor porcentaje de inhibición (Bautista, 2009; Huashuayo, 2016; Guzmán, 2014). Los porcentajes de inhibición generados, por las distintas concentraciones de extracto hidroalcohólico trabajadas, no superan el 50 % con respecto al control positivo, por ende, podemos afirmar que el extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” presenta una acción antibacteriana baja frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Al respecto Ramirez y Díaz (2007) y Cruz et al. (2010) afirman que ; si el porcentaje de inhibición de un extracto vegetal con respecto al control positivo, es mayor a 70% se considera una acción antibacteriana alta, si está entre 50 – 70 % intermedia y menor a 50% baja. La tabla 1, nos muestra la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”, frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615, siendo 6,25 mg/ml y 12,5 mg/ml respectivamente. Al respecto, cuando se trabaja con plantas medicinales es normal que los valores de CMI y CMB sean altos (Domingo y López, 2003), esto debido a que las plantas medicinales presentan pequeñas cantidades de principios activos (0,1 a 2% o < 0,01%)(Tinco, 1998). Además, debemos recordar que, en el extracto de un vegetal, los principios activos están combinadas con otros metabolitos secundarios que pueden suprimir su acción antibacteriana(OPS, 2019). En la mayoría de investigaciones con plantas medicinales (Huashuayo, 2016; Huamaní, 2021; Laynes, 2020; Guzmán, 2014; Castro, 2017; Romaní et al., 2017), se ha observado que: la CMI se ubica por debajo, de la menor concentración de extracto vegetal que genera un halo de inhibición en el método de Disco difusión 28 de Kirby – Bauer, al respecto la SEIMC (2000) afirma que en el método de Disco – Placa, la concentración de antibiótico presente en la interface entre bacterias en crecimiento y bacterias inhibidas, es próxima al valor de CMI obtenida por métodos de dilución. La CMB es superior y próxima a la CMI (SEIMC, 2000). Basado en estos aspectos, nuestros resultados si cumplen con esta condición. No se encontraron trabajos de investigación relacionados a la determinación del efecto antibacteriano del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”, constituyéndose el presente trabajo de investigación, como el primero en evaluarlo. La tabla 2, nos muestra los resultados del tamizaje fitoquímico del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”. Los metabolitos secundarios detectados fueron: alcaloides, aminas, antocianidinas, azúcares reductores, glicósidos cardiotónicos, flavonoides, fenoles, taninos, lactonas, cumarinas, saponinas, triterpenos, esteroides y azúcares. La presencia de metabolitos secundarios como; alcaloides, azúcares reductores, flavonoides, fenoles, taninos, lactonas, cumarinas, saponinas, triterpenos, esteroides y azúcares, estarían relacionados con la propiedad antibacteriana del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”. Al respecto los metabolitos secundarios presentes en un extracto vegetal, pueden generar acción antibacteriana mediante diferentes mecanismos. Los alcaloides gracias a su propiedad de intercalarse con el ADN, pueden detener la síntesis de proteínas, inducir la apoptosis e inhibir las enzimas del metabolismo de carbohidratos (Murphy, 1999; Domingo y López, 2003; Wink y Schimmer, 1999; Sepúlveda et al., 2003). Algunos azúcares reductores como la glucosa y la fructosa, tienen efecto antimicrobiano (Murphy, 1999; Domingo y López, 2003). Los flavonoides inhiben la síntesis de ADN, forman complejos con las proteínas solubles, extracelulares (adhesinas) y con la pared bacteriana, además pueden alterar las membranas microbianas (Lock de Ugaz, 1994; Murphy, 1999; Lizcano y Vergara, 2008; Domingo y López, 2003; Salazar, 2016). Los compuestos fenólicos inactivan los sistemas enzimáticos, y pueden destruir la pared y la membrana celular (Murphy, 1999; Chávez, 2011; Bruneton, 1993; Abud et al., 2015). Los taninos gracias a su propiedad de astringencia, pueden generar inhibición enzimática, privación de sustratos y actuar sobre las membranas (Murphy, 1999; Bruneton, 1993; Harrison, 1983; Muñoz, 1994; Domingo y López, 2003; Engels et al., 2011; Olivas et al., 2015).Las lactonas (sesquiterpénicas), 29 inducen la apoptosis (Murphy, 1999; Ballinas, 2016; Negrín, 2013). Las cumarinas generan efecto antimicrobiano por interacción con el ADN (Lock de Ugaz, 1994; Tinco, 1998; Murphy, 1999; Domingo y López, 2003; Salazar, 2016). Las saponinas alteran la permeabilidad de la membrana celular, generan lisis celular, alteran la pared celular e inducen la muerte celular programada (Murphy, 1999; Domingo y López, 2003; Bruneton, 1993; Díaz, 2009; Wang et al., 2000; Ito et al., 2007). Los terpenos pueden generar alteración de la integridad de la membrana celular (Murphy, 1999; Lock de Ugaz, 1994; Domingo y López, 2003; Trombetta et al., 2005; Bueno et al., 2009). Los esteroides tienes efecto antimicrobiano (Bruneton, 1993; Ávalos y Pérez, 2009). La glucosa, fructosa y sacarosa son ejemplos de azúcares con propiedades antimicrobianas (Murphy, 1999; Domingo y López, 2003; Vizcaíno et al., 2013). Estudios realizados por Romero (1994) y Ayala (2011),acerca de la composición química de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”, afirman que los metabolitos secundarios presentes en dicha parte son; taninos, fenoles, flavonoides, saponinas, azúcares reductores, triterpenos, esteroides, glicósidos cardiotónicos, lactonas y cumarinas. Estos resultados son semejantes a nuestros resultados, con la diferencia de que además se encontró alcaloides y aminas en nuestro trabajo. Esta diferencia de resultados podría deberse a varios aspectos, ya sea al tipo de reactivo empleado, a la ausencia del metabolito secundario, al tipo de solvente usado para extraer, a la presencia de sustancias extrañas o a una concentración en el orden de trazas del compuesto ensayado (Miranda y Cuellar, 2000). 31 VI. CONCLUSIONES 1. El efecto antibacteriano originado por el extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615, está en función a su concentración, pues a mayor concentración (200 mg/ml) se obtiene mayor efecto antibacteriano. 2. La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615, fue 6,25 mg/ml. 3. La Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615, fue 12,5 mg/ml. 4. El extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”, presenta metabolitos secundarios como; alcaloides, azúcares reductores, flavonoides, fenoles, taninos, lactonas, cumarinas, saponinas, triterpenos, esteroides y azúcares, los cuales serían responsables de la actividad antimicrobiana. 33 VII. RECOMENDACIONES • Evaluar el efecto antibacteriano de las hojas, flores, frutos y semillas de la Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”. • Evaluar el efecto antibacteriano del extracto hidroalcohólico y otros extractos de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”, frente a otras cepas bacterianas patógenas. • Evaluar el grado de toxicidad aguda media y la dosis de letalidad media del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”. • Aislar los metabolitos secundarios con propiedades antimicrobianas del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”, y evaluar su efecto antimicrobiano de modo independiente. • Evaluar el efecto inmunomodulador del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”. 35 VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abud, K., Bustos, L., Covo, E. y Fang, L.C. (2015). 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Constancia de identificación taxonómica de la Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”. Ayacucho – 2022. 53 Anexo 3. Certificado de calidad de la cepa Streptococcus pyogenes ATCC 19615 enviado por Gen Lab S.A.C. – 2022. 54 Anexo 4. Cepa comercial de Streptococcus pyogenes ATCC 19615, enviado por Gen Lab S.A.C. - 2022. 55 Anexo 5. Cultivo joven de Streptococcus pyogenes ATCC 19615 en Agar sangre. Ayacucho – 2022. 56 Anexo 6. Protocolo de preparación del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”. Ayacucho – 2022. 1.Recolectar 3 kg de raíz de pacha tara. 2. Lavar, desinfectar y dejar secar a T° ambiente por 1 semana. 3. Moler la muestra seca. 4. Macerar 500 g de polvo seco + 3L de etanol al 80 %, por una semana. 5. Filtrar la solución resultante. 6.Concentrar a 40 °C. 7.Almacenar en refrigeración. 57 Anexo 7. Preparación del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”. Ayacucho – 2022. 58 Anexo 8. Protocolo de determinación del efecto antibacteriano del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Ayacucho – 2022. Agar Mueller Hinton enriquecido con 5% sangre de carnero. 4.Incorporar los discos impregnados con distintos tratamientos: 1: Disco con agua destilada estéril. 2: Disco con 15 ug de eritromicina. 3: Disco con 10 mg/ml de extracto. 4: Disco con 50 mg/ml de extracto. 5: Disco con 100 mg/ml de extracto. 6: Disco con 150 mg/ml de extracto. 7: Disco con 200 mg/ml de extracto. 2 1 3 4 5 6 7 5.Incubar a 37°C por 24 horas en condiciones de anaerobiosis. 6.Medir el diámetro de los halos de inhibición. 5 6 7 1 2 3 4 10 mg/ml 50 mg/ml 100 mg/ml 150 mg/ml 200 mg/ml 1.Preparar el inóculo bacteriano. 3.Impregnar los discos de papel Whatman con el extracto hidroalcohólico. 1 2 3 4 5 6 7 59 Anexo 9. Determinación del efecto antibacteriano del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Ayacucho – 2022. 60 Anexo 10. Halos de Inhibición formados por las distintas concentraciones de extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Ayacucho – 2022. (+) (-) 10 mg/ml 50 mg/ml 100 mg/ml 200 mg/ml 150 mg/ml (+) (-) 10 mg/ml 50 mg/ml 100 mg/ml 200 mg/ml 150 mg/ml (+) (-) 10 mg/ml 50 mg/ml 100 mg/ml 150 mg/ml 200 mg/ml (+) (-) 10 mg/ml 50 mg/ml 100 mg/ml 150 mg/ml 200 mg/ml Placa 1 Placa 2 Placa 3 Placa 4 61 Anexo 11. Diámetro de halos de inhibición (mm), formados por las distintas concentraciones de extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Ayacucho – 2022. NÚMERO DE REPETICIÓN TRATAMIENTO DIÁMETRO DE HALO DE INHIBICIÓN (mm) PROMEDIO (mm) 1 10 mg/ml de extracto 6,65 7,31 2 7,9 3 7 4 7,7 1 50 mg/ml de extracto 9,2 9,50 2 10,1 3 9,7 4 9 1 100 mg/ml de extracto 10,5 10,45 2 10 3 11 4 10,3 1 150 mg/ml de extracto 11,5 11,55 2 11,4 3 11 4 12,3 1 200 mg/ml de extracto 11,8 12,05 2 12 3 12 4 12,4 1 15 𝝁𝒈 de eritromicina 25,7 26,30 2 27,6 3 27,25 4 24,65 62 Anexo 12. Porcentaje de Inhibición de las distintas concentraciones de extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” frente a Streptoccocus pyogenes ATCC 19615. Ayacucho – 2022. CONCENTRACIÓN DE EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO PORCENTAJE DE INHIBICIÓN (%) 10 mg/ml 27,8 50 mg/ml 36,1 100 mg/ml 39,7 150 mg/ml 43,9 200 mg/ml 45,8 63 Anexo 13. Prueba P de normalidad del diámetro de halos de inhibición, del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Ayacucho – 2022. TRATAMIENTO AD VALOR p 10 mg/ml de extracto 0,261 0,482 50 mg/ml de extracto 0,216 0,621 100 mg/ml de extracto 0,191 0,733 150 mg/ml de extracto 0,286 0,402 200 mg/ml de extracto 0,361 0,234 15 𝜇𝑔 de eritromicina 0,263 0,475 Valor de p ≥ 0,05 indica distribución normal de la muestra. 64 Anexo 14. Análisis de varianza (ANOVA), de halos de inhibición formados por los distintos tratamientos frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Ayacucho – 2022. Diámetro de Halo de Inhibición (mm) Suma de cuadrados gl Media cuadrática F Sig. Entre grupos Dentro de grupos Total 923,513 9,057 932,570 5 18 23 184,703 ,503 367,085 ,000 65 Anexo 15. Prueba de comparación múltiple t de Dunnet, de los halos de inhibición formados por los distintos tratamientos frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Ayacucho – 2022. Variable dependiente: Diámetro de Halo de Inhibición (mm) T de Dunnett (bilateral)a (I) Tratamiento (J) Tratamiento Diferencia de medias (I-J) Desv. Error Sig. Intervalo de confianza al 95% Límite inferior Límite superior 10 mg/ml de extracto 15 𝜇𝑔 de Eritromicina -18,98750* ,50158 ,000 -20,3726 -17,6024 50 mg/ml de extracto 15 𝜇𝑔 de Eritromicina -16,80000* ,50158 ,000 -18,1851 -15,4149 100 mg/ml de extracto 15 𝜇𝑔 de Eritromicina -15,85000* ,50158 ,000 -17,2351 -14,4649 150 mg/ml de extracto 15 𝜇𝑔 de Eritromicina -14,75000* ,50158 ,000 -16,1351 -13,3649 200 mg/ml de extracto 15 𝜇𝑔 de Eritromicina -14,25000* ,50158 ,000 -15,6351 -12,8649 *. La diferencia de medias es significativa en el nivel 0,05. a. Las pruebas t de Dunnett tratan un grupo como un control, y comparan todos los demás grupos con este. 66 Anexo 16. Protocolo de determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”, frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Ayacucho – 2022. 1. Agregar 1 ml a cada tubo. Caldo Mueller Hinton enriquecido con 5% sangre de carnero. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Extracto hidroalcohólico (200 mg/ml) 2. Agregar 1 ml al tubo 1, luego a partir de este agregar 1 ml al tubo 2 y así sucesivamente hasta el tubo 14. De este tomar 1 ml y descartar. Desechar Inóculo bacteriano (Streptococcus pyogenes ATCC 19615) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 3. Agregar 1 ml a cada tubo. 4.Incubar a 37 °C por 18 horas, en condiciones de anaerobiosis. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 5. Seleccionar 5 tubos consecutivos (tres con caldo transparente y dos con caldo turbio). 6.Sembrar por estrías, 1 asada de cada tubo en Agar Sangre. 7.Incubar a 37 °C por 24 horas, en condiciones de anaerobiosis. 8.Determinar la CMI y CMB. CMI CMB 67 Anexo 17. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara” frente a Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Ayacucho – 2022. CMI 6,25 mg/ml CMB 12,5 mg/ml Tubo 2 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 5 Tubo 6 CMI 6,25 mg/ml CMI 6,25 mg/ml CMB 12,5 mg/ml CMB 12,5 mg/ml Tubo 6 68 Anexo 18. Proceso de tamizaje fitoquímico del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”. Ayacucho – 2022. 69 Anexo 19. Tamizaje fitoquímico del extracto hidroalcohólico de la raíz de Hypseocharis bilobata killip “pacha tara”. Ayacucho – 2022. 16 H H: Extracto hidroalcohólico más agua 1: Reacción de Dragendorff 2: Reacción de Mayer 3: Reacción de Wagner 4: Reacción de Ninhidrina 5: Reacción de Antocianidinas 6: Reacción de Benedict 7: Reacción de Kedde 8: Reacción de Shinoda 9a: Reacción de Cloruro Férrico 9b: Reacción de Cloruro Férrico 10: Reacción de Baljet 11: Reacción de Bo