UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTÓBAL DE HUAMANGA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA Actividad antioxidante del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC). Stapf. “hierba luisa”. Ayacucho, 2021. TESIS PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL DE QUÍMICO FARMACÉUTICA Presentado por la: Bach. QUINTAS RIVERA, Rosmeri Asesor: Dr. Q.F. Edwin Carlos Enciso Roca AYACUCHO - PERÚ 2023 iii A mis padres y abuelos por su apoyo incondicional en este proceso. v AGRADECIMIENTOS A la Universidad Nacional de San Cristóbal de Huamanga por, acogerme en sus aulas durante mi periodo de formación profesional. A la Facultad de Ciencias de la Salud y la Escuela Profesional de Farmacia y Bioquímica, su plana docente con una prestigiosa trayectoria profesional por, haberme impartido los conocimientos necesarios en mi proceso de formación profesional. Al Dr. Q.F. Edwin Carlos ENCISO ROCA, por su indispensable colaboración y asesoramiento en el proceso de elaboración de tesis. Al. Q.F. Aldo TINCO JAYO, docente de la EP de Farmacia y Bioquímica de la UNSCH, por el apoyo y las sugerencias. Al Q.F. Marco ARONES JARA, docente de la EP de Farmacia y Bioquímica de la UNSCH, por el apoyo y las sugerencias. A todos aquellos que me apoyaron y guiaron para hacer posible y llegar a esta etapa. vii ÍNDICE GENERAL Página AGRADECIMIENTOS v ÍNDICE GENERAL vii ABREVIATURAS EMPLEADAS ix ÍNDICE DE TABLAS xi ÍNDICE DE FIGURAS xiii ÍNDICE DE ANEXOS xv RESUMEN xix I. INTRODUCCIÓN 1 II. MARCO TEÓRICO 3 2.1. Antecedentes 3 2.2. Cymbopogon citratus (DC). Stapf “hierba luisa” 5 2.3. Aceites esenciales 6 2.4. Compuestos fenólicos 10 2.5. Flavonoides 13 2.6. Radicales libres 14 2.7. Antioxidantes 14 2.8. Medición de la actividad antioxidante 14 III. MATERIALES Y MÉTODOS 19 3.1. Lugar de ejecución 19 3.2. Definición de la población y muestra 19 3.3. Procedimiento para la recolección de datos 19 3.4. Análisis de datos 26 IV. RESULTADOS 27 V. DISCUSIÓN 37 VI. CONCLUSIONES 45 VII. RECOMENDACIONES 47 VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 49 ANEXOS 55 ix ABREVIATURAS EMPLEADAS AH: Antioxidante RL: Radical libre DPPH: 1,1 – difenil – picril - hidrazilo ABTS: 2,2’ – azinobis – (3 - etilbenzotiazolina) – 6 – sulfónico FRAP: Poder antioxidante reductor del fierro TPTZ: 2,4,6 – tripiridil – triazina UV-VIS: Ultravioleta visible °C: Grados centígrados o Celsius GAE: Equivalente a ácido gálico QE: Equivalente a quercetina TEAC: Capacidad antioxidante equivalente al Trolox AE: Aceite esencial H: Horas mL: Mililitro L: Litro g: gramo mg: Miligramo Min: Minutos µg: microgramo µM: micromol µL: microlitro mmol: milimol PM: Peso molecular xi ÍNDICE DE TABLAS Página Tabla 1 Rendimiento del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022 29 Tabla 2 Características fisicoquímicas del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022. 30 Tabla 3 Tamizaje fitoquímico de aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022. 31 Tabla 4 Contenido de fenoles totales, flavonoides en el aceite de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022. 32 Tabla 5 Actividad antioxidante del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022 35 Tabla 6 Concentración inhibitoria cincuenta (IC50) del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022. 36 xiii ÍNDICE DE FIGURAS Página Figura 1 Estructura química de los compuestos activos del aceite esencial de Cymbopogon citratus. 6 Figura 2 Clasificación esquemática de los compuestos fenólicos. 12 Figura 3 Estructura básica de los flavonoides 13 Figura 4 Reducción del radical libre 1,1 difenil – 2 - picril - hidrazilo (DPPH) 15 Figura 5 Estructura de ABTS antes y después de la reacción con el antioxidante. 17 Figura 6 Porcentaje de inhibición del radical DPPH según la concentración del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022. 33 Figura 7 Porcentaje de inhibición del radical DPPH según la concentración del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022. 34 xv ÍNDICE DE ANEXOS Página Anexo 1 Certificado de identificación botánica de Cymbopogon citratus (DC). Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2021. 57 Anexo 2 Recolección de la muestra de Cymbopogon citratus (DC). Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022. 58 Anexo 3 Secado y obtención del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC). Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022. 59 Anexo 4 Determinación del rendimiento del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022 60 Anexo 5 Determinación de la densidad relativa del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022. 61 Anexo 6 Determinación del índice de acidez del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022. 62 Anexo 7 Procedimiento de tamizaje fitoquímico de Cymbopogon citratus (DC). Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022 63 Anexo 8 Protocolo para la determinación del contenido de fenoles totales del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC). Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022. 64 Anexo 9 Protocolo para la determinación del contenido de flavonoides del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC). Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022. 65 Anexo 10 Protocolo para la determinación de la capacidad antioxidante mediante el método de DPPH del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC). Stapf. Ayacucho 2022. 66 Anexo 11 Protocolo para la determinación de la actividad antioxidante mediante el método de ABTS, del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC). Stapf. “hierba luisa” Ayacucho 2022. 67 Anexo 12 Protocolo para la determinación de la actividad antioxidante mediante el método de FRAP del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC). Stapf. “hierba luisa”. Ayacucho 2022. 68 Anexo 13 Diluciones del ácido gálico para la curva de calibración para la cuantificación del contenido de fenoles totales. Ayacucho 2022. 69 Anexo 14 Curva de calibración del ácido gálico para la determinación del contenido de fenoles totales. Ayacucho 2022. 70 Anexo 15 Muestras para la cuantificación del contenido de fenoles totales del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022. 71 Anexo 16 Diluciones de la quercetina para elaborar la curva de calibración para la cuantificación del contenido de flavonoides. Ayacucho 2022. 72 xvi Anexo 17 Curva de calibración de la quercetina para la cuantificación del contenido de flavonoides. Ayacucho 2022. 73 Anexo 18 Muestras para la cuantificación del contenido de flavonoides del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022. 74 Anexo 19 Diluciones del radical DPPH para elaborar la curva de calibración del Trolox. Ayacucho 2022. 75 Anexo 20 Curva de calibración para la determinación de la actividad antioxidante según el método del DPPH con relación a las concentraciones del Trolox. Ayacucho 2022. 76 Anexo 21 Curva de calibración de la actividad antioxidante en función de las concentraciones de Trolox en el método DPPH. Ayacucho 2022. 77 Anexo 22 Muestra para la cuantificación de la actividad antioxidante por el método DPPH del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022. 78 Anexo 23 Diluciones según el método del ABTS para elaborar la curva de calibración del Trolox. Ayacucho 2022. 79 Anexo 24 Curva de calibración para la cuantificación de la actividad antioxidante según el método ABTS con relación a las concentraciones de Trolox. Ayacucho 2022. 80 Anexo 25 Curva de calibración de la actividad antioxidante en función de las concentraciones de Trolox en el método ABTS. Ayacucho 2022. 81 Anexo 26 Muestras para la cuantificación de la actividad antioxidante por el método ABTS del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf. “hierba luisa”. Ayacucho 2022 82 Anexo 27 Diluciones según el método FRAP para la elaboración de la curva de calibración del Trolox. Ayacucho 2022. 83 Anexo 28 Curva de calibración para la cuantificación de la actividad antioxidante; según el método de FRAP con relación a las concentraciones de Trolox. Ayacucho 2022. 84 Anexo 29 Cuantificación de la actividad antioxidante por el método de FRAP del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022. 85 Anexo 30 Análisis de varianza del porcentaje de la actividad secuestradora del radical DPPH y ABTS del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022 86 Anexo 31 Prueba de comparaciones múltiples de Tukey para determinar la diferencia significativa de la actividad antioxidante mediante los métodos DPPH y ABTS del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022 87 xvii Anexo 32 Estadístico de la actividad antioxidante de FRAP del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022. 88 Anexo 33 Matriz de consistencia de la Actividad antioxidante del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2021. 89 xix RESUMEN Los aceites esenciales son los productos de los metabolismos secundarios de las plantas, estos están siendo muy usados en el campo de la industria. Es por ello que el presente trabajo de investigación tuvo como objetivo determinar las características físico químicas, el contenido de fenoles totales, flavonoides y la actividad antioxidante mediante los métodos DPPH, ABTS y FRAP del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”; donde se realizó en los laboratorios de la Escuela Profesional de Farmacia y Bioquímica. El proceso de ejecución duró un periodo de 3 meses. El aceite esencial se obtuvo por el método de arrastre de vapor, donde se obtuvo un rendimiento de 0,34% de aceite esencial, los siguientes resultados se obtuvieron según el INEN (instituto ecuatoriano de normalización): densidad relativa de 0,879 ± 0,001 g/mL, índice de refracción de1,4760 ± 0,001, pH = 5; índice de acidez 15,75 ± 0,19 mg KOH/g de aceite, soluble en alcohol de 96° e insoluble en agua. El contenido de fenoles totales y flavonoides se expresó en gramo de aceite esencial (AE), obteniéndose 20,85 ± 0,54 EAG/g AE y de 16,26 ± 0,75 mg EQ/g AE, respectivamente. La actividad antioxidante para el radical DPPH fue 7,49 ± 0,60 mmol ET/g AE (30 mg/mL); ABTS 12,45 ± 0,18 mmol ET/g AE (20 mg/mL); y para FRAP de 23,72 ± 0,15 mmol ET/g AE (20 mg/mL). La concentración inhibitoria cincuenta (IC50) con el radical ABTS fue 23, 19 ± 0,28 mg/mL, mientras para el Trolox en ABTS fue: 67,60 µg/mL. En conclusión, el aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa” probablemente sea una especie con un potencial antioxidante Palabras clave: Cymbopogon citratus, aceite esencial, capacidad antioxidante. 1 I. INTRODUCCIÓN Actualmente en el Perú los estudios de las plantas nativas aún son muy nacientes en relación a la existencia de una inmensa variedad de plantas aborígenes, esto motiva a que se hagan estudios más minuciosos. La gran mayoría de las plantas aromáticas presentan actividad antioxidante que, son muy capaces de retrasar la oxidación de los componentes lipídicos.1,2 Es así que, los aceites esenciales son fracciones volátiles y muy aromáticas que son responsables de los aromas peculiares de las plantas, en su mayoría son extraídas por el método de arrastre de vapor. De la misma manera, estos aceites son sustancias volátiles que vienen a partir del metabolismo secundario de las plantas.2 El aceite esencial de hierba luisa es estudiada debido a que, en diferentes estudios mostró tener actividad farmacológica y de la misma manera que las fracciones de taninos y flavonoides presentan actividad antioxidante3, sin embargo no existen estudios de esta actividad en aceite esencial de muestras de nuestra región empleando métodos diversos como DPPH, ABTS y FRAP, de la misma forma se estudió esta actividad debido a que hay una serie de enfermedades que surgieron por la emergencia sanitaria y el estrés que probablemente originaron radicales en el organismo. En éstos últimos años se ha visto que los consumidores y las industrias de alimentos están mostrando mucho interés en reducir el empleo de alimentos sintéticos, es así que de esta manera se busca mejorar la alimentación en dietas saludables para el consumidor. La parte más importante de los antioxidantes está compuesta por una matriz que contiene a los metabolitos secundarios como es el 2 caso de los fenoles y flavonoides. El aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC). Stapf está compuesta por varios compuestos, en mayor porcentaje está el geranial, neral y estereoisómeros de citral (terpenoide); el geranial es el que le da el olor característico a limón. Muchos de los componentes de los aceites esenciales de hierba luisa tienen diferentes efectos como: antioxidantes, antibacterianas, antifúngicas y antiprotozoarios.2 La determinación de la actividad antioxidante se realizó mediante 3 métodos: captación del radical libre de DPPH expresado como mmol ET/g AE de muestra, captación del radical libre ABTS expresado como mmol ET/g AE de muestra y captación reductora del hierro (FRAP) expresado como mmol ET/g AE de muestra. OBJETIVOS Objetivo General Determinar la capacidad antioxidante del aceite esencial extraída de las hojas de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa” Objetivos Específicos • Determinar las características físico químicas del aceite esencial de “hierba luisa”. • Determinar el contenido de fenoles totales y flavonoides en el aceite esencial. • Determinar la actividad antioxidante del aceite esencial mediante los métodos de DPPH, ABTS y FRAP. 3 II. MARCO TEÓRICO 2.1. Antecedentes Olarte2, realizó el estudio con el objetivo de determinar la actividad antioxidante de extractos de Cymbopogon citratus (DC. Stapf) provenientes de matrices tratadas con radiación UV-B. La planta se recolectó en Bogotá, se usó el método de extracción por arrastre de vapor. Se reporta un porcentaje de rendimiento de 0,3250%. De la misma manera, se evidenció la presencia de fenoles totales cuando presentó un aumento porcentual de 19,3 % con respecto al extracto control. La actividad antioxidante se determinó mediante dos ensayos: DPPH (1,1-difenil-2 picril hidrazilo) Y ABTS (2,2- azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6-ácido sulfónico); el resultado para DPPH obtenido fue 68,17 ± 0,94 %; mientras que para ABTS fue. 91,78 ± 0,01 %. Camus et al.4, realizaron el estudio de la caracterización fisicoquímica del aceite esencial de Cymbopogon citratus”, obtenidas en Huaraz-Ancash; en la cual se usó el método por arrastre de vapor; reportan una densidad relativa de 0,8829 y pH 5. Por otro lado, se identificaron compuestos por espectrofotometría de masa (CG/EM), siendo las más resaltantes alfas citral con un (17,40%), beta citral (11,99%) y beta mirceno (56,54%) Vásquez et al.5, realizaron el estudio con el objetivo de determinar las propiedades fisicoquímicas y antioxidantes del aceite esencial de Cymbopogon citratus; obtenidas en Puebla-México, donde se realizó mediante los métodos de vaporización y destilación asistida por microondas; donde reportan un porcentaje de rendimiento de 0,752%, un índice de refracción (1,483 ± 0,001) a 20 °C y una densidad (0,873 ± 0,005 g/mL) a 27 °C. Mientras que por la técnica de resonancia magnética se determinó que el citral es el componente mayoritario del aceite y el contenido de compuestos fenólicos fue de 149,2 ± 6,0 mg equivalentes de ácido gálico por 100 mL de aceite. 4 La actividad antioxidante por el ensayo de DPPH (1,1-difenil-2 picril hidrazilo) fue de 44,06 ± 0,20 mg de Trolox por mL de aceite esencial. Anggraeni et al.6, realizaron el estudio con el objetivo de determinar la bioactividad del aceite esencial de limoncillo (Cymbopogon citratus) como antioxidante, recolectadas en la finca nativa Cileles Jatinangor-Indonesia; donde por el método de destilación reportan un rendimiento del 0,24%. También se realizó la actividad antioxidante por el ensayo de DPPH (1,1-difenil-2 picril hidrazilo), en la cual se obtuvo un porcentaje de inhibición en las siguientes concentraciones: 10 mg/mL (31,33 %) y a la concentración de 20 mg/mL (60,37%). Menut et al.7, realizaron el estudio de plantas aromáticas de África Occidental Tropical. XI. Composición química, propiedades antioxidantes y anti radicales de los aceites esenciales de tres especies de Cymbopogon de Burkina Faso, donde el aceite se obtuvo por el método de hidrodestilación; y reportan que los compuestos en mayor porcentaje de Cymbopogon citratus fueron: geranial (44,6%), neral (330%) y mirceno (10,7%). También se determinó la actividad antioxidante y antirradical, donde Cymbopogon citratus presento mayor actividad antirradical frente a las especies de C. proximus y C. giganteus. Ruiz8, realizó el estudio con el objetivo de determinar la composición química y la actividad antioxidante de aceites esenciales obtenidas de cinco especies de plantas cultivadas en Yucatán, donde reporta que, las muestras recolectadas fueron en época seca y lluviosa. La obtención del aceite fue por el método de hidrodestilación. Los compuestos mayoritarios que se identificaron en el aceite esencial de Cymbopogon citratus fueron α y β citral. Por otro lado, la actividad antioxidante fue determinada por la captación de radical libre DPPH (1,1-difenil-2 picril hidrazilo), donde la especie de Cymbopogon citratus obtuvo mayor porcentaje de captación de radicales libres: 90,1 % y 81,3 %; recolectadas en época seca y lluviosa respectivamente. Lu et al.9 , realizaron un estudio de la determinación de la actividad antioxidante de extractos crudos de citronelal de Cymbopogon citratus por tres diferentes métodos cuyas muestras fueron recolectadas en Bukit Putindon, Malasia; las cuales incluye los métodos DPPH Y FRAP; para la extracción de la muestra se usó cloroformo en la proporción de 1:3 y se concentró en un rotavapor; reportan un porcentaje de rendimiento de 1,9 % de aceite esencial; la actividad antioxidante con el método 5 DPPH fue 2 ± 0,01 µg/mL, mientras que con el método del FRAP fue 0,09 ± 0,002 mmol/g y un IC50 con el radical DPPH: 1998 ± 0,02 µg/mL. 2.2. Cymbopogon citratus (DC). Stapf “hierba luisa” 2.2.1. Clasificación taxonómica 2.2.1.1. Clasificación taxonómica según el sistema Cronquist A. 1998. REINO : PLANTAE DIVISIÓN : MAGNOLIOPHYTA CLASE : LILIOPSIDA SUB CLASE : COMMELINIDAE ORDEN : CYPERALES FAMILIA : POACEAE GÉNERO : Cymbopogon ESPECIE : Cymbopogon citratus (DC) Stapf N. V : “hierba luisa” Fuente: Certificado emitido por la Bióloga Laura Aucasime Medina, especialista en Taxonomía y Sistemática de Plantas. (ANEXO 1) 2.2.2. Nombres comunes Hierba luisa, caña santa, lemongrass, té de limón, citronela y otros.10 2.2.3. Descripción botánica Cymbopogon citratus es una planta terrestre perenne de 0,5 a 2 m de altura. Presenta hojas aromáticas con peculiar olor a limón de aproximadamente de 60 cm a 1 m de largo aproximadamente, tiene ramas alargadas y son algo penduladas. Presenta espatas lanceoladas con espiguillas en pares, una sésil y la otra pedicelada, racimos bifurcados. También presenta una espiguilla sésil línea lanceolada de 4 a 5 cm de largo. Es una planta que no florece o lo hace de muy rara vez.11 2.2.4. Propiedades farmacológicas Los diversos estudios realizados a hojas de Cymbopogon citratus evidenciaron propiedades antioxidantes,2, 3, 5, 12antimicrobiana,2, 13efecto anti-Trypanosoma cruzi,11 diurético y antidiarreico.13 2.2.5. Propiedades y uso medicinal Las hojas se utilizan en infusión mezclada con limón para tratar el escalofrío, también se usa como coadyuvante en la digestión y es muy efectiva para tratar el dolor de pecho, cabeza; en el caso de problemas estomacales ayuda a tratar las diarreas 6 fuertes, úlceras, gastritis; ayuda a disminuir afecciones de los nervios, corazón, reumatismo; también se usa como diurético y en algunos casos para regular el ciclo menstrual. 14 2.2.6. Hábitat y distribución Es originaria de la zona tropical del Sureste de Asia, India y Ski Lanka. En el Perú se cultivan en las regiones tropicales y subtropicales.14 2.2.7. Composición química Los componentes mayoritarios de esta planta son los monoterpenos geranial (41,8%) y neral (34,9%), que estos constituyen una mezcla de estereoisómeros que se conoce como citral, representando el 76,7% del aceite esencial de Cymbopogon citratus.15,16También se encuentran varios componentes en menor cantidad tales como; los terpenos, alcoholes, aldehídos, cetonas, estrés, compuestos aromáticos y también se encuentran los flavonoides (luteolina, isoorientina y derivados).17 Figura 1. Estructura química de los compuestos activos del aceite esencial de Cymbopogon citratus. Fuente: Saldaña y Torres.17 2.3. Aceites esenciales Son fracciones líquidas, volátiles y aromáticas naturales que son responsables de los aromas de las flores que, generalmente son extraídas por arrastre con vapor de agua. También se puede contextualizar como unas mezclas de compuestos volátiles que, 7 son productos del metabolismo secundario de las plantas, éstas están contenidas mayormente por hidrocarburos de la serie polimetilénica del grupo de los terpenos.18 También se describe a los aceites esenciales como mezclas muy complejas de hasta de 100 componentes que entre ellas se encuentran: los compuestos alifáticos de bajo peso molecular (alcanos, alcoholes, aldehídos, cetonas, ésteres y ácidos), los monoterpenos, sesquiterpenos y fenilpropanos. Mayormente estos aceites son de un aroma agradable, aunque no todos, tal es el caso del ajo y de la cebolla que contienen sustancias azufradas.19 2.3.1. Características Los aceites esenciales son en su totalidad líquidos a una temperatura ambiente, estos también, prácticamente transparentes, incoloros o casi moderadamente coloreados, se volatilizan, son aromáticos, y mayormente son menos densos que el agua, de la misma manera son solubles en alcoholes de alta graduación y en solventes orgánicos apolares, son muy insolubles en agua (menos los aceites que presentan fenoles), lipofílicos, presentan alto índice de refracción, actividad óptica.17 Son oxidables fácilmente y se polimerizan para dar productos de naturaleza resinosa.17 2.3.2. Localización En su mayoría, la presencia de los aceites esenciales se le atribuye a la presencia de unas estructuras especializadas de las plantas, en su mayoría se las pueden encontrar en superficies de las plantas.20 Podemos encontrar aceites esenciales en: • Las flores • Los frutos • Las hojas • Las raíces • En las semillas • El pericarpio de los frutos • Los Tallos.20 2.3.3. Clasificación Los aceites esenciales son compuestos muy complejos, debido a esto para la clasificación se tomaron muchos criterios como: • Según su origen: pueden ser naturales y sintéticas. 8 • Según su naturaleza química de los compuestos en mayor porcentaje: monoterpenoides, sesquiterpenoides o fenilpropanoides. • Según la consistencia: se pueden encontrar esencias fluidas, bálsamos y oleorresinas que, esta última se puede obtener haciendo uso de solventes orgánicos.17 2.3.4. Composición química Mayormente los aceites esenciales se componen por hidrocarburos terpénicos (terpenos y terpenoides), se les puede identificar porque no presentan aroma, son muy volátiles e inflamables.17 Los aceites que en su composición carecen de oxígeno son los hidrocarburos (monoterpenos, sesquiterpenos y fenilpropano), a diferencia de los hidrocarburos terpénicos son aromáticos y alifáticos.17 Y los terpenos funcionarizados (compuestos terpenoides) son los que presentan oxígeno en su composición, también estos tienen función alcohol, fenol aldehído, cetona, éter, éster o peróxido. Los monoterpenoides y sesquiterpenoides se componen de 10 y 15 átomos de carbonos que derivan de las biosíntesis de geranilpirofosfato.17 Los compuestos de los aceites esenciales que presentan grupos funcionales terpenoides son los responsables del aroma de los aceites, es así que en un estudio se determinó que los compuestos mayoritarios del Cymbopogon citratus son: el geranial (27,04 %), mirceno (27,04 %) y neral (19,93 %);21 también algunas pueden presentar efectos farmacológicos.17 Se pueden clasificar en: • Cetonas: Pueden ser mucolíticas y presentan un bajo contenido antiséptico. Ejemplo: tuyona.17 • Aldehídos: Pueden ser antiinflamatorios, sedativos, antivirales y presentan fuerte poder antiséptico. Ejemplos: Citral, geraniáceos, aldehído cinámico, propanal, etc.17 • Ésteres: Presentan aromas frutales, efecto calmante directo sobre el SNC y antifúngicos. Ejemplo: Acetato de geranilo.17 • Alcoholes: Muy volátiles y antisepsia media. Baja toxicidad. Ejemplos: Linalol, geraniol, mentol, etc.17 • Fenoles y ácidos fenólicos: Presentan antisepsia elevada, estimulantes, aromatizantes, analgésicos locales y 9 posibles hepatotóxicos. Ejemplos. Eugenol y atenolol.17 • Polifenoles: Flavonoides: antihemorrágico, antiarrítmicos, antinflamatorios, antirradicales libres, etc.17 • Heterósidos: Pueden ser cicatrizantes, antiinflamatorios, etc.17 • Sustancias nitrogenadas Alcaloides: tóxicos y presentan actividad farmacológica a muy baja dosis.17 2.3.5. Método de destilación:22 • Arrastre de vapor Para este método se hace uso del agua, generalmente se hace uso de una muestra vegetal fresca y esta debe estar cortada en trozos pequeños, luego se transfiere a un recipiente cerrado y tiene que estar sometida a una corriente de vapor de agua, posteriormente se arrastra la esencia que luego se condensa y finalmente se recolecta y separa de la fracción acuosa.22,23 2.3.6. Calidad La cantidad de los aceites esenciales varía según los diferentes casos: • Según qué parte de la planta se va usar. • Según el lugar de donde se recolectaron. • Según las condiciones de cultivo. • Según el método de extracción. • Como se almacena. • Según el régimen climático.24 2.3.7. Aplicaciones y usos Antiguamente los aceites esenciales eran denominados por los Alquimistas como “alma de las plantas”, porque contenían muchos compuestos químicos naturales.17 Generalmente los aceites esenciales son usados por sus propiedades aromáticas en la industria de los alimentos, en la cosmética y algunos productos para la limpieza; sin embargo, se usa en la industria farmacéutica por sus propiedades farmacológicas,17 tal es el caso del aceite esencial del geranio que se usa en aromaterapia, también funciona como tónico, antiséptico y tiene muy buenos resultados para el cansancio; también se puede mencionar al aceite de lavanda que está muy ligado con las quemaduras y el tratamiento de algunas enfermedades 10 cutáneas, del mismo modo; la hierba luisa tiene efectos antifúngicos, antioxidantes, etc. Las características antioxidantes de los aceites esenciales van a depender de su composición química, es así que, los compuestos que presentan fenoles e hidrocarburos terpénicos son capaces de inhibir una oxidación y se puede incluir como un alimento o aditivo que sirve para conservar de una manera natural los productos alimentarios.25 2.3.8. Toxicidad En algunos aceites esenciales se puede apreciar toxicidad, por eso es muy importante que, al momento de hacer uso, se debe tener precaución en la dosis, ya que están contenidas de numerosas sustancias naturales.17 La FDA catalogó como segura al aceite esencial de Cymbopogon citratus “hierba luisa” por su bajo contenido de toxicidad. Se puede añadir que, el DL50 del extracto fluido al 80% de Cymbopogon citratus es de 440,58 mg/Kg. del peso corporal.26 2.4. Compuestos fenólicos Son moléculas que presentan uno o más grupos hidroxilo a un anillo aromático. Al igual que las vitaminas, los fenoles son considerados antioxidantes muy importantes. Muchos de estos compuestos fenólicos se pueden encontrar en las plantas y son clasificados de acuerdo a su grupo funcional. Son responsables del color y las propiedades sensoriales de las plantas, un ejemplo es la astringencia de las frutas y hortalizas.27 Los fenoles se clasifican en fenoles simples, ácidos fenólicos, cumarinas. Xantonas, quinonas, betacianinas, lignanos y ligninas y se demostró que, muchos de estos componentes presentan diferentes actividades, dentro de ellas ser antioxidante. Algunos de los compuestos químicos responsables de la actividad antioxidante de los aceites esenciales son: eugenol, timol y carvacrol. Para entender la estructura de los compuestos fenólicos es de suma importancia empezar con la estructura del fenol, que es la molécula básica que, se compone de un anillo aromático (fenil) unido a un grupo hidroxilo (OH). El anillo aromático tiene funciones muy importantes en las propiedades antioxidantes.27, 2.4.1. Fenoles simples Estos componentes se caracterizan por tener dos (en las posiciones 1,2,1,3 o 1,4) o tres (en las posiciones 1,3,5 o 1,2,3) grupos hidroxilo en el anillo aromático.27 11 Así como sus propiedades antibióticas, antiparasitarias, presentan propiedades antioxidantes. Como ejemplo de ello se puede mencionar a los siguientes: Catecol, resorcinol e hidroquinona.27 2.4.2. Ácidos fenólicos Están conformados por dos grupos tales como: los ácidos hidroxibenzoicos y los ácidos hidroxicinámicos. Es importante decir que, a mayor separación o distanciamiento del grupo carbonilo al anillo aromático y la existencia de más de un grupo hidroxilo aumentan la capacidad antioxidante de los compuestos.27 2.4.3. Cumarinas Las cumarinas se encuentran solo en trazas en algunos aceites esenciales de los cítricos, presentan un anillo aromático unido a un heterociclo oxígeno. Se denominan compuestos fenólicos cuando en particular, un grupo hidroxilo está unido a un esqueleto de estructura cumarina. Como ejemplo se pueden mencionar a umbeliferona.27 2.4.4. Xantonas, estilbenos y benzofenonas Los tres tipos de compuestos se pueden encontrar de manera natural en muchas plantas. Por ejemplo, en las raíces y frutas exóticas se hallaron a las xantonas y benzofenonas, mientras que particularmente en las uvas se hallaron a los estilbenos.27 2.4.5. Quinonas Las quinonas se caracterizan por presentar un anillo aromático diona completamente conjugado; mientras que poseen características antioxidates.27 2.4.6. Betacianinas Son pigmentos que se pueden encontrar en los alimentos como es el caso de la remolacha. Como responsable de la coloración de la remolacha se mencionan a la betanidin y la isobetanidin. La betanidin perteneciente a la remolacha presenta un potencial antioxidante, así mismo, también las betacianidinas fueron halladas en las tunas.27 2.4.7. Lignanos y ligninas Los lignanos son compuestos fenólicos dímeros, y derivan de la fenilalanina y alcoholes cinámicos que están presentes en muchos alimentos. Los lignanos demostraron tener una capacidad antioxidante muy significativa.27 12 Las ligninas se describen como unos compuestos fenólicos complejos y son consideradas como la segunda más abundante en biopolímeros en el reino vegetal después de la celulosa.27 2.4.8. Clasificación de fenoles totales Los fenoles se clasifican en función a la cantidad de grupos fenoles que presentan, del número y grupo funcional que se une al anillo aromático y de los elementos estructurales que se unen unos anillos a otros.28 Figura 2. Clasificación de los compuestos fenólicos. Fuente: Santamaria.28 2.4.9. Actividad terapéutica Los fenoles forman parte de un grupo amplio de antioxidantes que, contribuyen a disminuir el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares tales como el ácido gálico, resveratrol, y la quercetina que ya han sido certificados por presentar actividad en contra de las alergias, la hipertensión, la inflamación, la artritis, entre otras actividades terapéuticas. Dentro de la actividad antioxidante se demostró que, muchos de estos componentes presentan diferentes actividades; algunos de los 13 compuestos químicos responsables de la actividad antioxidante de los aceites esenciales son: Eugenol, timol y carvacrol.27 2.5. Flavonoides Los flavonoides son un grupo de compuestos polifenólicos que están muy distribuidos en las frutas y vegetales; son responsables de la coloración de las flores y frutas.29 Pueden presentarse desde moléculas muy simples hasta compuestos muy polimerizados con unos pesos moleculares altos, presentan una estructura química que consta de tres anillos.29 A la vez son sustancias sintetizadas por la mayoría de las plantas vasculares. Los flavonoides, a excepción de las catequinas, los flavonoides están presentes en las plantas y alimentos. Se estima que, en la dieta diaria se ingiere de uno a dos gramos aproximadamente de flavonoides.30 Figura 3. Estructura básica de los flavonoides Fuente: Pérez.29 2.5.1. Clasificación Son clasificados en: flavonas y flavonoles, auronas, isoflavonas y neoflavonoides, flavan-3-oles, catequinas, leucoantocianinas, antocianidinas, deoxiantocianidinas y antocianinas.27 2.5.2. Actividad terapéutica Una de las actividades más destacadas, quizá por ser la más estudiada de los flavonoides; es la antiinflamatoria. A parte de ser antinflamatoria, los flavonoides presentan las siguientes actividades terapéuticas: antineoplásico (quercetina), cardiotónicos (3-metil-quercetina), antitrombóticas (rutina), disminución del colesterol, protección y regeneración hepática (silimarina), antiulcerosos (kaemferol y quercetina), antimicrobianos (quercetina y baicalina), antibacterial (crisina y rutina), 14 antiviral (crisoeriol), antifúngica (cloroflavona), anticancerígenos (quercetina), entre otros.30 2.6. Radicales libres Son átomos o grupos de átomos que presentan un electrón desapareado o libre, de esta manera los radicales son muy reactivos ya que tienen la capacidad de captar un electrón de moléculas estables con el propósito de alcanzar su estabilidad electrónica, las moléculas a las que quitó un electrón, también quedan desapareados; así convirtiéndose en un radical libre para luego quitar un electrón a otra molécula; de esta manera formará una reacción en cadena. La vida media de los radicales libres es de microsegundos, aun así, tiene la capacidad de reaccionar con todas las sustancias presentes a su alrededor a su alrededor y de esta manera provoca daños a las moléculas, membranas celulares y tejidos. Algunos terpenos que están presentes en los aceites esenciales presentan actividad antioxidante y antirradicales libres.31 Principales especies reactivas del oxígeno o sustancias prooxidantes:32 • Radical hidroxilo (OH*) • Peróxido de hidrógeno (H2O2) • Anión superóxido (O2 -) • Oxigeno singlete (1O2) • Óxido nítrico (NO) • Peróxido (O2-) • Ozono (O3) 2.7. Antioxidantes Es cualquier sustancia que previene o aplaza una oxidación de un sustrato o sustancia oxidable. Como se sabe, los órganos y las células del cuerpo también presentan unos sistemas antioxidantes, estos pueden ser enzimáticos o no enzimáticos; todos actúan potenciándose para neutralizar las formas del oxígeno, produciendo un conjunto de antioxidantes.33 2.8. Medición de la actividad antioxidante Actualmente gracias al interés que se tiene por los posibles efectos beneficiosos de las plantas se han estado desarrollando un gran número de métodos para determinar esta propiedad que es la capacidad antioxidante de los extractos. Los métodos que mayormente son utilizados para determinar la actividad antioxidante 15 se caracterizan por su simplicidad y reproducibilidad; y son FRAP (Poder antioxidante reductor de hierro), DPPH (1,1 difenil-2-picrilhydrazil) y ABTS (2,2-azinobis-3-etil- benzotiazolina-6-ácido sulfónico). El método FRAP se caracteriza en que los antioxidantes posibles de los extractos vegetales son sustancias capaces de reducir el ion férrico al estado ferroso, de esta manera el ion forma un complejo coloreado dando positivo a la actividad antioxidante del vegetal. Por otra parte, los métodos DPPH y ABTS se basan en medir la capacidad del extracto de la muestra en neutralizar los radicales libres presentes en los reactivos.34,35 Para la medición de la actividad antioxidante en aceites se debe tener en cuenta la temperatura del ambiente de trabajo ya que, estas son sustancias volátiles y podría mostrar cambios en la absorbancia, dónde se pueden detectar partículas que no son evidentes cuando se trabaja a una temperatura ambiente.36 2.8.1. Ensayo de DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazilo) El principio de este método se basa en la reducción del radical DPPH por los antioxidantes del extracto de la muestra. El radical se presenta en una forma estable, a su vez es soluble en etanol que se neutraliza mediante un proceso de transferencia de hidrógeno y presenta una coloración púrpura, esta coloración va disminuyendo a medida que se va añadiendo la muestra contenida de sustancias antioxidantes. La actividad antioxidante se mide según la decoloración y a una longitud de onda (λ) 515 nm. Las características ventajosas de este método es que se hace de forma rápida, sencilla y no requiere de un equipamiento mayor; como desventaja presenta que solo se puede disolver en medios orgánicos.34 Figura 4. Reducción del radical libre 1,1 difenil-2-picril-hydrazilo (DPPH) Fuente: Herrera.34 16 Los resultados obtenidos son presentados de maneras diferentes, en su mayoría, estos resultados son expresados como el valor de la concentración máxima de la media inhibitoria (IC50), esto se define como la cantidad usada de antioxidante para disminuir la concentración inicial de DPPH al 50%. El valor de esta actividad se halla de manera gráfica en dónde, se incluye el porcentaje de la inhibición versus la concentración del extracto.37 2.8.2. Ensayo de ABTS (ácido 2,2’azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) Este ensayo, originalmente estaba basado en la activación de la metilglobina con peróxido de hidrógeno en presencia de ABTS para posteriormente producir un radical catión en la presencia o ausencia de antioxidantes. Actualmente, este ensayo se basa en una reacción SET y HAT, en la que el radical se genera luego de una reacción que puede ser química (persulfato potasio), enzimática (peroxidasa, mioglobulina) o ya sea electroquímica. Una vez generado el radical ABTS ya sea por medio de enzimas o de manera química pasa a presentar nuevas características y se mide a una longitud de onda λ 734 nm. La ventaja de usar este método es que presenta una capacidad de solubilizarse en medios acuosos y en medios orgánicos; este ensayo es más indicado en casos de hacer ensayos coloreados, así como de los compuestos fenólicos, esto se debe a que con estos compuestos presentan una absorción máxima y a la vez próxima a la región infrarroja (λ 734 nm), de esta manera se reduce la posibilidad de interferencia de los compuestos coloreados que absorben en la región del visible.37 17 Figura 5. Estructura de ABTS antes y después de la reacción con el antioxidante. Fuente: Zutela, et al.38 2.8.3. Ensayo FRAP (poder férrico reductor) Este método se basa en la reacción SET, que tienen que ver con la reducción del complejo de la tripiridiltriazina férrica al complejo ferroso por medio de un antioxidante en medio ácido. Posteriormente con esta reacción se obtiene un cambio de color que se va controlando mediante una medición de absorbancia a una longitud de onda 593 nm por un periodo de 30 minutos. Como patrón estándar se usa el Trolox y se expresa (µmol Trolox/g o µmol Trolox/L). Este método presenta ciertas críticas tales como: se trabaja a un pH no fisiológico; a una longitud de onda de 593 nm se pueden absorber otros compuestos tales como, la bilirrubina oxidasa que, posteriormente podría aumentar el valor del FRAP; por su potencial de reducción de Fe (III) a Fe (II) que es 0,77 V. cualquier sustancia con un potencial redox inferior podría hacer reducir al Fe (III) y de esta manera podría hacer que se presente valores no certeros de FRAP; el ácido ascórbico aparte de reaccionar con el ión férrico podría reaccionar con el ión ferroso para posteriormente formar radicales libre.34 18 19 III. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Lugar de ejecución El presente trabajo de investigación se desarrolló entre los meses de julio a setiembre del año 2022, en los laboratorios de Farmacognosia y Toxicología de la Escuela Profesional de Farmacia y Bioquímica de la Facultad de Ciencias de las Salud, Ayacucho-Perú. 3.2. Definición de la población y muestra 3.2.1. Población Hojas de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”, que crece en el valle del Distrito de Huamanguilla, Provincia de Huanta, Departamento de Ayacucho a una altitud de 2642 msnm. 3.2.2. Muestra 20 kg de hojas de Cymbopogon citratus “hierba luisa”, adquiridas en el mercado de Piscotuna, provenientes del Distrito de Huamanguilla de la provincia de Huanta, departamento de Ayacucho. 3.2.3. Unidad de análisis Aceite esencial extraída de las hojas Cymbopogon citratus “hierba luisa” 3.3. Procedimiento para la recolección de datos 3.3.1. Recolección de la muestra vegetal La planta (hierba luisa) se adquirió en el mercado de Piscotuna, provenientes del Distrito de Huamanguilla de la provincia de Huanta, departamento de Ayacucho. Posteriormente, la planta fue llevada a la Bióloga Laura Aucasime Medina, Especialista en Taxonomía y Sistemática de plantas para la identificación correspondiente. (ANEXO 1) 20 3.3.2. Preparación de la muestra Se recolectó 20 kg de muestra fresca, posterior se hizo el secado sobre papel Kraft (para reducir el porcentaje de humedad) en un ambiente cerrado y se obtuvo una cantidad equivalente a 14,5 kg de muestra en seca.39 3.3.3. Obtención del aceite esencial de Cymbopogon citratus “hierba luisa” La obtención del aceite fue a partir del pre secado de las hojas de Cymbopogon citratus “hierba luisa”. La obtención del aceite esencial fue por arrastre de vapor, donde la extracción fue realizada en las instalaciones de la institución TERPENS de la Escuela Profesional de Ingeniería Química. El equipo usado para la extracción tuvo una capacidad del tanque de agua: 25 L, capacidad del tanque de almacenamiento de materia prima: 15 Kg, tiempo de espera de la primera gota: 2 horas y tiempo de destilación: 4 horas. Para la extracción se tuvo que calentar el agua destilada por un período de 3 horas, luego se añade la muestra y el procedimiento de destilación duró 4 horas aproximadamente, posterior se obtuvo dos fases (acuosa y oleosa) y finalmente mediante la decantación se separó ambas fases donde; se obtuvo un total de 50 mL de aceite esencial para su estudio. Se almacenó en refrigeración en un frasco ambar.39 3.3.4. Determinación del rendimiento de aceite esencial de Cymbopogon citratus “hierba luisa” La determinación del rendimiento se realizó a partir del volumen obtenido de la cantidad de muestra en la extracción. Se usó la siguiente fórmula:39 %𝑅𝐴𝐸 = 𝑉𝑜𝑙 𝐴𝐸 (𝑚𝐿) 𝑃𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 (𝑔) × 100 Donde: %RAE: Porcentaje del rendimiento del aceite esencial. Vol. AE (mL): Volumen del aceite esencial obtenido en mililitros. P muestra (g): Peso de la muestra en gramos. 3.3.5. Parámetros fisicoquímicos del aceite esencial 3.3.5.1. Determinación de las características organolépticas Las características evaluadas fueron:39 • Determinación del olor La determinación del color se hizo con una tira de papel secante, seguido se introdujo 21 el papel a una parte del aceite para determinar si el aceite presenta el olor característico de “hierba luisa”.39 • Determinación del color Se realizó en un tubo de ensayo limpio y seco, posterior se tomó una alícuota hasta las tres cuartas partes con la muestra para la evaluación preliminar.39 • Determinación de sabor La determinación del sabor se realizó tomando una pequeña alícuota para proceder a probar el sabor.39 • Determinación de la textura Para la determinación de la textura se tomó una alícuota y se hizo el uso del tacto.39 3.3.5.2. Determinación de la densidad relativa INEN 38.40 La determinación de densidad relativa se hizo haciendo el uso de un picnómetro; primero se pesó el picnómetro vacío, picnómetro con agua y picnómetro con la muestra (aceite esencial); la prueba se hizo por triplicado. Los resultados se expresaron de la siguiente manera: D25= 𝑀1−𝑀 𝑀2−𝑀 Donde: M1: peso del picnómetro + muestra (g) M2: peso del picnómetro + (g) M: peso del picnómetro vació (g) Los resultados solo se tomaron hasta la tercera cifra. 3.3.5.3. Determinación del índice de refracción INEN 42.41 El equipo usado fue de la marca CARL ZEISS JENA. Primero, se ajustó el equipo con una gota de agua destilada, seleccionando la zona del espectro visible, luego se tomó una gota de la muestra y se colocó en el prisma de medición; se cerró el prisma y se realizó la lectura. 3.3.5.4. Determinación del pH El equipo usado fue de la marca Lutron PH-208 (CONCYTEC). La determinación del pH se realizó haciendo uso de una tira reactiva de pH. Se introdujo el pH-metro en la muestra contenida en el tubo de ensayo.39 3.3.5.5. Determinación de la solubilidad Azaña et al.39 La determinación de la solubilidad se realizó haciendo uso de 3 tubos; en la cual se añadieron una cantidad de 0,5 mL de aceite esencial, luego a estas 22 muestras se añadió 5 mL de agua, 5 mL de etanol al 70% y 5 mL de etanol al 96%, respectivamente. Finalmente se observó si se produjo algún enturbiamiento en las muestras. 3.3.5.6. Determinación del índice de acidez INEN 38.42La determinación del índice de acidez se realizó haciendo uso del alcohol etílico al 95% (neutralizado). A tres matraces se añadió un peso de 2 gramos de muestra respectivamente, seguido se añadió 60 mL de alcohol etílico neutralizado y 5 gotas de fenolftaleína, luego se realizó la valoración con KOH 0,1 N hasta que se obtuvo una coloración rosada tenue. La determinación del índice de acidez se calculó con la siguiente formula: 𝐼𝐴 = 5,61 𝑋 𝑉 𝑃 Dónde: IA: Índice de acidez P: peso en gramos de la muestra V: volumen de hidróxido de potasio (KOH) 0,1 N usado en mL. 3.3.6. Cuantificación del contenido de fenoles totales. El contenido de fenoles totales de determinó haciendo el uso del método de Folin- Ciocalteu.43 Primeramente, se procedió a preparar muestras en concentraciones diferentes tales como: 10 mg/mL, 20 mg/mL y 30 mg/mL las cuales se conservaron refrigerados hasta su posterior uso. En un tubo de ensayo se tomó una alícuota de 50 µL de muestra, se llevó a un volumen de 1 mL con metanol; se agregó 0,5 mL de reactivo Folin-Ciocalteu (Merk ®) 0,2 N; se llevó al vórtex y se reposó por 5 minutos a una temperatura ambiente. Seguidamente se añadió 2,5 mL de Na2CO3 5% (carbonato de sodio), se mezcló nuevamente y se llevó a incubar en la oscuridad por un periodo de 40 minutos. Pasado el tiempo se hizo las lecturas de las absorbancias de las muestras a una longitud de onda de 725 nm (Espectrofotómetro UV – Vis GENESYS 10S – THERMO SCIENTIFIC) contra un blanco de reacción. Para la curva de calibración se preparó una solución de ácido gálico a una concentración de 50 µg/mL en metanol; a partir de la solución madre (ácido gálico) se tomaron alícuotas de 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 mL y se completó con agua destilada a 1 mL para formar concentraciones de 10, 20, 30, 40 y 50 µg/mL. Todos los ensayos se expresaron por triplicado y los resultados se 23 expresaron como miligramos equivalentes de ácido gálico por gramo de extracto (mg EAG/g de AE). 3.3.7. Cuantificación de flavonoides Para la cuantificación, se realizó el método descrito por Zhishen et al.44, con algunas modificaciones. Se prepararon muestras en concentraciones de 10 mg/mL, 20 mg/mL y 30 mg/mL; se tomó una alícuota de 0,5 mL de muestra de cada concentración y se llevó a un volumen de 1 mL con metanol. Luego se añadió 0,15 mL de nitrito de sodio al 5%, se dejó reposar durante un período de 5 minutos; seguido se añadió 0,15 mL de cloruro de aluminio al 10% y se dejó reposar durante 6 minutos. Pasado el tiempo se agregó 2 mL de hidróxido de sodio al 4%, se mezcló y se llevó todos los tubos a un volumen de 5 mL con metanol. Finalmente, se homogenizó la mezcla en un vórtex y se dejó reposar por 15 minutos a una temperatura ambiente. Las lecturas de las absorbancias se realizaron a una longitud de onda de 510 nm (Espectrofotómetro UV – GENESYS 10S – THERMO SCIENTIFIC), contra un blanco de reacción. La curva de calibración fue preparada con una solución de quercetina a una concentración de 200 µg/mL en metanol. A partir de la solución de quercetina se tomaron alícuotas de 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; y 1mL y se completó con agua destilada a un volumen de 1 mL para formar concentraciones de (40, 80, 120, 160 y 200 µg/mL). Finalmente, todos los ensayos se realizaron por triplicado y los resultados se expresaron en (mg QE/g de AE). 3.3.8. Método de la actividad secuestradora del radical 1,1 – difenil – 2 – picril – hidrazilo (DPPH) El ensayo se realizó de acuerdo al método descrito por Brand – Williams y Col., con algunas modificaciones hechas por Thaipong et al.43 Para la cuantificación se prepararon muestras en concentraciones de 10 mg/mL, 20 mg/mL y 50 mg/mL que se conservaron en refrigeración. Se preparó una solución patrón (SP) a partir del radical libre DPPH de 24 mg/100 mL en metanol. Luego se procedió a preparar una solución trabajo (ST) en la cual se tomó 10 mL de la SP y se adicionó 45 mL de metanol, se procedió a medir la absorbancia inicial a una longitud de onda de 515 nm en la cual se ajustó a 1,1 ± 0,02 con metanol. Posterior se tomó un alícuota de 150 µL de muestra en un tubo de ensayo, luego se añadió 2850 µL de ST, se homogenizó en un vórtex y se llevó a reposo por un periodo de 30 minutos en la oscuridad. Las lecturas de las absorbancias de las muestras se realizaron a una 24 longitud de onda 515 nm (Espectrofotómetro UV – Vis GENESYS 10S – THERMO SCIENTIFIC), contra un blanco de reacción. El porcentaje de la actividad secuestradora del radical libre fue calculada con la siguiente formula. % 𝑑𝑒 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑠𝑒𝑐𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎𝑑𝑜𝑟𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝐷𝑃𝑃𝐻 = ⌊ 𝐴𝐷𝑃𝑃𝐻 − 𝐴𝑀𝑝 𝐴𝐷𝑃𝑃𝐻 ⌋ 𝑥100 Donde ADPPH y AMP corresponde a la absorbancia inicial del DPPH y muestra respectivamente. De la misma manera, se preparó una curva de calibración con Trolox; se pesó 12,5 mg de Trolox y se llevó a un volumen de 50 mL con metanol. Luego se tomaron unas alícuotas de (0, 1, 2, 4, 6, 8 mL) aforados en una fiola de 10 mL con metanol y se homogenizó. Pasado el tiempo se tomaron 150 µL de cada dilución en un tubo de ensayo, a este mismo se le agregó 2850 µL de ST para luego homogenizar en un vórtex. Las muestras se incubaron en oscuridad por un período de 30 minutos. Las lecturas de las absorbancias de las muestras se realizaron a una longitud de onda de 515 nm (Espectrofotómetro UV – Vis GENESYS 10S – THERMO SCIENTIFIC), contra un blanco de reacción. Todas las muestras se realizaron por triplicado. Así mismo los resultados fueron expresados como (mmolET/g AE). 3.3.9. Método del secuestramiento del catión radical de ácido 2,2’ – azinobis – (3 – etilbenzotiazolina) – 6 – sulfónico (ABTS°+) Este método se realizó de acuerdo al método descrito por Arnao y Col., modificado por Thaipong et al.43 Para la cuantificación se prepararon muestras en concentraciones de 10 mg/mL, 20 mg/mL y 30 mg/mL que se conservaron en refrigeración. Primeramente, se preparó una solución patrón de ABTS (SP), que esta estaba constituida por 40,6 mg de ABTS aforado en una fiola de 10 mL con agua destilada y 7 mg de persulfato de potasio aforado en una fiola de 10 mL con agua destilada, ambas diluciones se mezclaron en un frasco ámbar y se dejó reposar en oscuridad durante un periodo de 12 horas. Se preparó una solución de trabajo (ST) a partir de la SP, se tomó 1 mL de la SP diluido con 60 mL de metanol, se realizó la lectura de la absorbancia inicial a 734 nm, se ajustó a un rango de 1,1 ± 0,02 con metanol. Luego se tomó un alícuota de 150 µL de muestra en un tubo de ensayo, se adicionó 2850 µL de ST (ABTS), se homogenizó en un vórtex y se dejó reaccionar en la oscuridad por un periodo de 12 horas. Las 25 lecturas de las absorbancias de las muestras fueron realizadas a una longitud de onda de 734 nm (Espectrofotómetro UV – Vis GENESYS 10S – THERMO SCIENTIFIC), contra un blanco de reacción. El porcentaje de la actividad secuestradora del radical libre se calculó de acuerdo a la siguiente ecuación: % 𝑑𝑒 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑠𝑒𝑐𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎𝑑𝑜𝑟𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝐴𝐵𝑇𝑆 = ⌊ 𝐴𝐴𝐵𝑇𝑆 − 𝐴𝑀𝑝 𝐴𝐴𝐵𝑇𝑆 ⌋ 𝑥100 Donde AABTS y AMP corresponde a la absorbancia inicial del DPPH y muestra respectivamente. De la misma manera, se preparó la curva de calibración a partir de una solución stock que fue preparada con 12,5 mg de Trolox en un volumen de 50 mL de metanol, de esta misma se tomaron alícuotas de (0,5; 1; 2; 3 y 4 mL) las cuales fueron aforadas en una fiola de 10 mL con metanol y se homogenizó. Una vez agitada, se tomaron alícuotas de 150 µL de cada dilución en un tubo de ensayo, a este mismo tubo se le añadió 2850 µL de ST (ABTS), de la misma manera se homogenizó en un vórtex y se dejó reaccionar en oscuridad por un periodo de 2 horas. Las lecturas de las absorbancias de las muestras se realizaron a una longitud de onda de 734 nm (Espectrofotómetro UV – Vis GENESYS 10S – THERMO SCIENTIFIC), contra un blanco de reacción. Todas las muestras se realizaron por triplicado. A si mismo los resultados se expresaron como (mmolET/g AE) 3.3.10. Método de reducción de hierro (FRAP) El ensayo se realizó de acuerdo al método establecido por Benzei y Strain, modificado por Thaipong et al.43 Para la cuantificación se prepararon muestras en concentraciones de 10 mg/mL, 20 mg/mL y 30 mg/mL que se conservaron en refrigeración. Primeramente, se preparó una solución de trabajo (ST) contenida por tres soluciones: la primera solución (S1) fue un buffer acetato con un pH 3,6 (310 mg acetato de sodio + 1,6 mL de ácido acético que fueron aforados a 100 mL con agua destilada); la segunda solución (S2) fue de 2,4,6 tripridylls – triazine (TPTZ) que se preparó (31,2 mg de TPTZ aforados a 10 mL con una solución HCl 40 mM) y mientras que la tercera solución (S3) fue de cloruro férrico hexahidratado que se preparó (54,1 mg de cloruro férrico aforados a 10 mL con metanol). La solución de trabajo (ST) se preparó en una proporción de 25; 26 2,5 y 2,5 de las soluciones S1, S2 y S3 respectivamente; la mezcla se llevó a baño María a una temperatura de 37 °C por un período de 30 minutos. Se tomó una alícuota de 150 µL de muestra, se añadió 2850 µL de ST para posteriormente homogenizar en un vórtex, se dejó incubar en un baño María a una temperatura de 37 °C por un periodo de 30 minutos. Las lecturas de las absorbancias de las muestras se realizaron a una longitud de onda de 593 nm (Espectrofotómetro UV – Vis GENESYS 10S – THERMO SCIENTIFIC), contra un blanco de reacción. De la misma manera, se preparó una curva de calibración a partir de una solución stock que fue preparada con 12,5 mg de Trolox que, se aforó a un volumen de 50 mL con metanol; de esta solución stock se tomó alícuotas de 0; 0,5; 1; 2; 4; 6 y 8 mL, las cuales se aforaron a un volumen de 10 mL con metanol y se agitó por un período de 5 minutos. Se tomó una alícuota de 150 µL de cada dilución y se añadió 2850 µL de ST para luego ser homogenizada en un vórtex; se dejó incubar en baño María a una temperatura de 37 °C por un periodo de 30 minutos. Las lecturas de las absorbancias se realizaron a una longitud de onda de 593 nm (Espectrofotómetro UV – Vis GENESYS 10S – THERMO SCIENTIFIC), contra un blanco de reacción. Todas las muestras se realizaron por triplicado. A si mismo los resultados se expresaron como (mmolET/g AE). 3.4. Análisis de datos Los resultados fueron expresados como las medias ± desviación estándar de tres repeticiones y fueron presentadas en figuras y tablas. Las diferencias entre las medidas de fenoles totales, flavonoides y la capacidad antioxidante por los ensayos del DPPH, ABTS y FRAP se analizaron mediante el análisis de varianza (ANOVA) haciendo uso del programa estadístico SPSS (Stadistical Package for Socials Sciences) versión 26,0 en español. 27 IV. RESULTADOS 28 29 Tabla 1. Rendimiento del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022. Aceite esencial Peso de muestra (g) Peso seco de muestra (g) Volumen (mL) aceite esencial Porcentaje de rendimiento (%) Hierba luisa 20 000 g 14 500 g 50 mL 0,34% 30 Tabla 2. Características fisicoquímicas del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022. Características fisicoquímicas Físicas Químicas Organolépticos Color Amarillo cristalino pH 5 Olor Característico “hierba luisa” Sabor Característico Índice de Acidez 15,75 ± 0,19 mg KOH/g AE Textura Oleosa Densidad relativa 0,879 ± 0,001 g/mL Índice de refracción 1,4760 ± 0,001 Solubilidad Agua Insoluble Alcohol 70% Moderadamente soluble Alcohol 96% Soluble 31 Tabla 3. Tamizaje fitoquímico del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022. ENSAYO METABOLITOS RESULTADO Ninhidrina Aminoácidos - Kedde Cardenólidos + Wagner Alcaloides - Mayer Alcaloides - Dragendorff Alcaloides - Baljet Compuesto lactónico (Coumarinas) - Shinoda Flavonoides + Lieberman Terpenos + Reacción de FeCl3 Fenoles + Fehling Azucares reductores - Benedict Azúcares reductores - Prueba de espuma Saponinas - LEYENDA: (-) : Ausencia (+) : Presencia 32 Tabla 4. Contenido de fenoles totales, flavonoides en el aceite de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022. Muestra Fenoles totales mg EAG/g AE Flavonoides mg EQ/g AE Aceite esencial “hierba luisa” 20,85 ± 0,54 16,28 ± 0,75 33 p<0,05 Figura 6. Porcentaje de inhibición del radical DPPH según la concentración del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022. 12,8 33,27 60,45 96,17 0 20 40 60 80 100 120 AE 10 mg/mL AE 30 mg/mL AE 50 mg/mL Trólox 0,2 mg/mL % d e i n h ib ic ió n d e l ra d ic a l D P P H Concentración 34 p<0,05 Figura 7. Porcentaje de inhibición de radical ABTS según la concentración del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022. 29,7 47,77 58,66 70,27 0 10 20 30 40 50 60 70 80 AE 10 mg/mL AE 20 mg/mL AE 30 mg/mL Trólox 0,1 mg/mL % d e i n h ib ic ió n d e l ra d ic a l A B T S Concentración 35 Tabla 5. Actividad antioxidante del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022. Los resultados son el promedio ± la D.E. de tres repeticiones. Muestra DPPH ABTS FRAP Aceite esencial Cymbopogon citratus “hierba luisa” mmol ET/g AE mmol ET/g AE mmol ET/g AE 7,49 ± 0,60 12,45 ± 0,18 23,72 ± 0,15 36 Tabla 6. Concentración inhibitoria cincuenta (IC50) del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022. Muestra IC50 Aceite esencial Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa” (mg/mL) DPPH Media ± D. E ABTS Media ± D. E 42,54 ± 0,06 23,19 ± 0,28 Trolox µg/mL 123,78 67,60 Los resultados son el promedio ± la D.E de tres repeticiones. 37 V. DISCUSIÓN Los aceites esenciales son fracciones volátiles que vienen a partir del metabolismo secundario de las plantas,2 muy aromáticas que a la vez son responsables de los aromas peculiares de las plantas. El aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf está compuesta por varios compuestos, en mayor porcentaje está el geranial, neral, mirceno y estereoisómeros de citral (terpenoides); el geranial es el que le da el olor característico a limón; mientras en menor porcentaje se encuentran algunos derivados fenólicos como el geraniol, citronelol, eugenol, etc.36,45 Y es así que muchos de los componentes de los aceites esenciales de hierba luisa tienen diferentes efectos tales como: antioxidantes, antibacterianas, antifúngicas y antiprotozoarios.2 La obtención de aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf se realizó mediante el método de arrastre de vapor que, es uno de los métodos más conocidos para la obtención de aceites.46 En la tabla 1; se muestran los resultados del porcentaje de rendimiento al aceite esencial presentes en Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”, recolectadas en la provincia de Huanta, departamento de Ayacucho; donde se obtuvo un porcentaje de rendimiento de 0,34%; este porcentaje se determinó a partir del volumen obtenido en mililitros con relación a la cantidad de muestra en gramos,47 otro reporte evidenció un rendimiento de 0,69% de una muestra de Cymbopogon winterianus recolectada en Guatemala,48 por otro lado una especie de C. citratus recolectada en Colombia evidenció rendimientos diferentes en la cual las muestras fueron expuestas a la radiación solar en la que la muestra con menor exposición a la radiación obtuvo un 38 rendimiento de 0,2357% y mientras que la muestra con mayor irradiación obtuvo un rendimiento de 0,325%.2 El rendimiento de los aceites depende de muchos factores, tal es el caso de la época de cosecha, el tratamiento que se le da a la planta o el método utilizado para su extracción, por otro lado, estos resultados se demuestran que las plantas que son cultivadas y expuestas a recibir irradiación presentan mayor rendimiento.2,39,49 En la tabla 2; se muestran los resultados de las características organolépticas y fisicoquímicas del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”, donde se evidenció lo siguiente; color: amarillo cristalino; olor y sabor característico (hierba luisa) y textura: oleosa, el género Cymbopogon presenta en su composición química al citronelal que es responsable del olor característico a limón de este género;9 dicho esto se puede deducir que en este estudio se obtuvo una característica similar en la prueba de olor. Otro reporte evidenció características organolépticas similares como, color: amarillo, olor: suigéneris, sabor: astringente y amargo, y textura: aceitosa.39 También dentro de las características fisicoquímicas se obtuvieron datos de una densidad relativa de 0,879 g/mL ± 0,001 g/mL; índice de refracción 1,4760 ± 0,001; en cuanto a la solubilidad se determinó que con el (agua es insoluble, con el alcohol 70% es moderadamente soluble y con el alcohol 96% es soluble); pH de 5 y el índice de acidez 15,75 ± 0,19 mg KOH/g AE; otro estudio evidenció una densidad relativa de 0,898 g/mL; un índice de refracción 1,4730; en cuanto a la solubilidad (es no miscible con el agua, moderadamente miscible con el alcohol de 70% y miscible con el alcohol de 96%); pH de 5 y un índice de acidez de 21,318.39 Otro estudio evidencio las características organolépticas como olor: fuerte olor a limón; color: amarrillo pálido; apariencia: transparente, y dentro de las características físico químicos evidenció una densidad relativa de 0.8793: índice de refracción de 1,485; pH: 5.00.50 Los aceites presentan una densidad inferior al agua, el índice de refracción oscila entre 1,4830-1,4890 a una temperatura de 20 °C y el pH está alrededor de 5-6.49 Como se puede observar los resultados que se evidenciaron se asemejan a los valores representados por otros autores.39,49,50 En la tabla 3; se muestran los resultados del tamizaje fitoquímico del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”, donde se evidenció la presencia de algunos metabolitos como: cardenólidos, flavonoides, terpenos y fenoles (Anexo7). 39 Mientras que un estudio realizado con muestras recolectadas en el caserío de Trigopampa, distrito de Otuzco -Trujillo, reporta el tamizaje fitoquímico a partir del aceite esencial de Cymbopogon citratus, en las cuales se evidenció la presencia de compuestos fenólicos, triterpenos y esteroides, taninos, aminas libres y azúcares reductores;51 Así mismo en otro estudio se reportan la presencia de metabolitos en tres especies de Cymbopogon citratus, C. cf. martini y C. cf. nardus procedentes de Riobamba – Ecuador, en las cuales se evidenció la presencia positiva de alcaloides (Dragendorff y Mayer) en las tres especies, la presencia de triterpenos y esteroides fue positiva para las especies de C. citratus y C. nardus, la especie C. nardus evidenció la presencia de azúcares reductores (Fehling) como positivo.46 En los resultados se evidencia la presencia de compuestos fenólicos, esto se considera importante debido a que gracias a este metabolito el aceite esencial de C. citratus presenta actividades farmacológicas como antibacterianas y antioxidante.52 En la tabla 4; se presentan el contenido de fenoles totales, flavonoides presentes en el aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf. “hierba luisa”; obteniéndose como resultado 20,85 ± 0,54 mg EAG/g AE para fenoles y 16,28 ± 0,75 mg EQ/g AE para flavonoides. Los resultados fueron obtenidos mediante la curva de calibración, para fenoles totales el estándar usado fue el ácido gálico evidenciando un coeficiente de correlación de 0,9903 (Anexo 14); mientras que para la cuantificación de flavonoides se usó como estándar la quercetina, en donde se evidenció un coeficiente de correlación de 0,9909 (Anexo 17). Los resultados de este estudio superan a los resultados evidenciados de aceite esencial de una muestra de C. citratus recolectados en Colombia, dónde reportan el contenido de fenoles totales en un rango de 13,41± 2,42 mg EAG/g de AE.2 Mientras que otras literaturas evidencian resultados obtenidos de una muestra de aceite esencial de C. citratus recolectados en Ecuador, dónde se reportó la presencia de fenoles totales y flavonoides con resultados de 10,481 mg EAG/g de AE y 32,613 mg EQ/g AE respectivamente,53 otro estudio demostró la presencia de fenoles totales de una muestra recolectada en Puebla – México con un resultado de 149,2 mg EAG/g de AE.5 y otra literatura evidenció resultados de muestras procedentes de Chiapas –México dónde evidenció la presencia de fenoles y flavonoides (extracto metanólico) con los resultados: 6,39 mg EAG/g AE y 4,16 mg EQ/g AE respectivamente.54 Los resultados obtenidos de los fenoles totales en los 40 aceites de C. citratus es atribuido a que el reactivo Folin – Ciocalteu interactúa con el grupo OH del geraniol, y eugenol ya que éste es el compuesto mayoritario en el aceite esencial de esta especie que le brinda la actividad antioxidante y al tipo de solvente que se usa para la extracción del aceite (extracción metanólica, hidroalcohólico 50:50); también los resultados varían de acuerdo a la parte de la planta usada para la extracción, así como al usar solo una parte especifica de la panta así como las hojas que estén en buen estado pues, se obtendrán mejores resultados, también tiene que ver el tipo de tratamiento de la planta y el tiempo de cosecha.2,13,55En nuestro caso para la extracción se usaron las hojas y el solvente fue el agua. Finalmente, la propiedad de los fenoles y flavonoides en las plantas es proteger es proteger del daño celular y un estudio demostró que al adicionar estos compuestos en la dieta podría generar una protección parecida en el organismo.56 En la figura 6, se presentan el porcentaje de inhibición del radical DPPH según la concentración del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”, obteniéndose como resultado (10 mg/mL: 12,80 ± 0,81%; 30 mg/mL 33,27 ± 2,10% y 50 mg/mL 60,45 ± 0,98 %), mientras que la actividad del Trolox fue 96,17 % a una concentración de 0,2 mg/mL. Los resultados que se evidenciaron presentan diferencias significativas entre la capacidad antioxidante y cada una de las concentraciones. (ρ < 0,05) (Anexo 30). De la misma manera, estos resultados se evidenciaron realizando una curva de calibración usando el Trolox como estándar; y así es como para el método DPPH se obtuvo un coeficiente de correlación de: 0,997 (Anexo 20). En este caso el método de DPPH se fundamente en que, el ensayo debe ser realizado en un medio orgánico, como el caso metanólico, en la que hay una reacción con los compuestos antirradicales que son poco polares que están presentes en los aceites esenciales, el cual esta actividad se midió espectrofotométricamente mediante la decoloración de las muestras que, se torna de un color violeta a amarillo a una longitud de onda de 517 nm.35 El radical DPPH es ampliamente usado para así probar la capacidad de eliminación de los radicales libres presentes en diferentes productos naturales y es así que ha sido aceptado como un modelo para el estudio de los radicales.57 Por otro lado, una literatura evidenció la actividad antioxidante de una muestra de C. citratus recolectadas en Colombia, en la cual usó el mismo método de extracción, el resultado para DPPH obtenido fue 68,17 ± 0,94 %.2 Otro estudio 41 evidencia la actividad antioxidante de los tallos de C. citratus por el método DPPH, en la cual mostró una mínima actividad antioxidante con un valor de 809 ppm (no se reporta los resultados en otras concentraciones) y un porcentaje de inhibición en las siguientes concentraciones: 10 mg/mL (31,33 %) y a la concentración de 20 mg/mL (60,37%).6 En la figura 7, se presentan el porcentaje de inhibición del radical ABTS según la concentración del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”, obteniéndose como resultado (10 mg/mL: 29,70 ± 0,44 %, 20 mg/mL 47,77 ± 0,56 % y 30 mg/mL: 58,66 ± 0,36 %), mientras que la actividad del Trólox fue 70,27 % a una concentración de 0,1 mg/mL. Los resultados que se evidenciaron presentan diferencias significativas entre la capacidad antioxidante y cada una de las concentraciones. (ρ < 0,05) (Anexo 30). De la misma manera estos resultados se evidenciaron realizando una curva de calibración usando el Trólox como estándar para el método ABTS, en la cual se obtuvo un coeficiente de correlación de 0,9987 (Anexo 24). El método de ABTS sugiere ser realizado en medio metanólico para el caso de aceites dónde se evidencia que en la reacción se forma el catión ABTS•+, este mismo sufre una decoloración que va de verde azulado intenso a verde azulado tenue que posteriormente es medido a una longitud de onda de 734 nm.35 La presencia de los compuestos aromáticos predomina en esta especie; esto podría ser la explicación a los resultados relativamente bajos, pero la actividad antioxidante se debe a la presencia de los compuestos fenólicos y algunos terpenos de los derivados fenólicos como: geraniol, citronelol, eugenol, etc.;36,45 también se podría mencionar que los aceites son sustancias volátiles y justamente las sustancias volátiles se encuentran en menor proporción que los compuestos no volátiles, es muy importante el buen almacenamiento de estos aceites, ya que en temperaturas altas podría perderse estas sustancias (volátiles) dónde se encuentran generalmente los compuestos antioxidantes (eugenol, geraniol, citronelol, etc.);36 dicho esto, posiblemente una de las causas para obtener resultados relativamente bajos en este estudio fue que, probablemente no hubo un buen almacenamiento y el ambiente de trabajo no estuvo en la temperatura indicada. Por otro lado, una literatura evidenció la actividad antioxidante de una muestra de C. citratus recolectadas en Colombia, en la cual usó el mismo método de extracción, el resultado obtenido para ABTS fue 91,78 ± 0,01 %.2 42 Mientras que otro estudio evidenció la actividad antioxidante por el método ABTS de muestras de C. citratus recolectadas en Colombia dónde se obtuvo el siguiente resultado: 1477 ± 4,1 mg Trolox/L.12 En la tabla 5, se presenta la actividad antioxidante del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa” obteniéndose como resultado para los tres métodos: DPPH (30 mg/mL: 7,49 ± 0,60 mmol ET/g AE); ABTS (20 mg/mL: 12,45 ± 0,18 mmol ET/g AE) y FRAP (20 mg/mL: 23,72 ± 0,15 mmol ET/g AE), se puede observar que para el método de DPPH se usa una concentración diferente a los métodos de ABTS y FRAP, esto fue debido a que se obtuvo mejor resultado con respecto a las concentraciones inferiores. De la misma manera se evidenciaron realizando una curva de calibración usando el Trolox como estándar para los tres métodos: DPPH, ABTS y FRAP; en la cual se obtuvieron los siguientes coeficientes de correlación: 0,997 (Anexo 20), 0,9987 (Anexo 24) y 0,9999 (Anexo 28) respectivamente. Según los resultados obtenidos en este estudio por los métodos de DPPH y ABTS, se puede notar que los valores obtenidos con el primer método son inferiores a los valores obtenidos por el segundo; esto podría deberse a que el DPPH es un radical que se obtiene al instante, mientras que el ABTS se obtiene mediante una reacción de 16 horas, debido a esto se considera que el radical DPPH sea más estable con respecto al radical ABTS que es menos estable y transitorio; así mismo, las variaciones que existen en los resultados de estos dos métodos es que el radical ABTS es menos selectivo en comparación al radical DPPH, de este modo el radical DPPH no reacciona con los flavonoides que no presentan grupos hidroxilo, tampoco con ácidos aromáticos que presenten un solo grupo hidroxilo; asimismo el radical ABTS es soluble en un medio orgánico y acuoso, de esta manera permite la evaluación de los antioxidantes hidrofílicos y lipofílicos, de este último se puede deducir que los compuestos presentes en el extracto podrían ser hidrofílicos y ser más sensibles a esta técnica (ABTS); otra razón de los cuales los valores del DPPH son bajas es que la reacción es reversible ya que es una de las características de este radical al momento de interactuar con compuestos fenólico como por ejemplo el Eugenol (compuesto de C. citratus) y dando como resultado a lectura bajas en la actividad antioxidante.35,37 En el caso del método FRAP; la capacidad reductora del catión Fe3+ forma un complejo con el TPTZ, esta formación se evidencia por la 43 coloración violáceo y esta coloración se va intensificando por la reducción de Fe3+ a Fe2+ en la cual se incrementa la absorbancia al ser leídas a una longitud de onda de 593 nm.35 Por otro lado una literatura evidenció el estudio de la actividad antioxidante por este método (FRAP) de muestras de C. citratus recolectadas en Colombia dónde se obtuvo el siguiente resultado 4146,9 ± 12,1 µmol de Fe2+/L.12 Otro estudio evidencia la actividad antioxidante de extractos crudos de Citronela y Cymbopogon citratus, en las cuales las muestras fueron recolectadas en Malasya; mediante los métodos DPPH y FRAP: se obtuvo un resultado de 2,00 ± 0.01 µg/mL y 0,09 ± 0,002 mmol/g; es así que, la actividad antioxidante de esta especie es relativamente baja según este estudio.9 Los resultados relativamente bajos obtenidos en la mayoría de los trabajos posiblemente se deba a la composición química del aceite de esta especie, muy a aparte de los métodos de extracción y la determinación de la actividad antioxidante; ya que, en su composición mayormente se encuentran los compuestos aromáticos como: geranial, citronelal, mirceno, etc. Y en un menor porcentaje los compuestos fenólicos y derivados fenólicos tales como: geraniol, eugenol y citronelol.21,45 En la tabla 6, se presentan la concentración inhibitoria cincuenta (IC50) donde se evidencia los siguientes resultados: IC50 Cymbopogon citratus DPPH (42,54 ± 0,06 mg/mL) y ABTS (23,19 ± 0,28 mg/mL); mientras para el Trolox se obtuvo lo siguiente en los dos métodos DPPH y ABTS: 123.78 y 67,60 µg/mL, respectivamente. Hernández,54 reporta a partir de la infusión realizada en medio acuoso donde obtuvo un IC50 0,325 ± 0,009 mg/mL. Es así que otra literatura reporta una estudio de muestras provenientes de Taiwán donde, determina la actividad antioxidante de los terpenos de la uva como: α-pineno, limoneno, mirceno y geraniol; donde determina la actividad antioxidante mediante el método de DPPH; obteniendo como resultado un IC50 de; 12,57 ± 0,18 mg/mL; 13,35 ± 0,26 mg/mL; 26,08 ± 2,28 mg/mL; 40,83 ± 1,68 mg/mL respectivamente para cada terpeno; demostrando así que el α-pineno tuvo un valor relativamente más alto en este estudio;58 de esta manera se puede confirmar que el Cymbopogon citratus también presenta en su composición química estos terpenos que tengan actividad antirradical; Ruiz,8 reporta a partir de la extracción mediante el uso del equipo Clevenger; donde determina la composición química de Cymbopogon citratus por cromatografía (HPLC) encontrándose; α-pineno, limoneno, 44 mirceno, geraniol y Linalol. A menor concentración inhibitoria 50, mayor será la capacidad antioxidante de la muestra. El IC50 tiene una relación con respecto al contenido de fenoles y flavonoides, es decir a mayor concentración de metabolitos secundarios, menor será el IC50 y esto significa que mayor será la actividad antirradical.35,54 De este modo según los resultados obtenidos en este estudio comparando con el Trolox se observa evidentemente que, este tiene un potencial antioxidante frente a las muestras con resultados de: DPPH y ABTS con 123.78 y 67,60 µg/mL, teniendo en cuenta estos resultados de Trolox se puede decir que, existe una posible mejor actividad antirradical presentada por el método ABTS (23,19 ± 0,28 mg/mL) frente al método DPPH (42,54 ± 0,06 mg/mL); esto indica que el aceite volátil a la concentración 23,19 mg/mL probablemente es capaz de evitar el daño oxidativo en una sustancia; también si menor es el valor de IC50, el aceite volátil tendrá mejor eficacia antirradical; factores como el método de extracción, condiciones de cultivo, parte de la planta usada, etc.; afectan la composición química de los aceites esenciales.8 45 VI. CONCLUSIONES 1. El aceite esencial extraída de las hojas de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”, presenta moderada actividad antioxidante que se encuentra en relación al contenido de fenoles y flavonoides 2. Las características físico químicas del aceite esencial “hierba luisa”; fueron las siguientes: rendimiento de 0,34 %, densidad relativa 0,879 g/mL ± 0,001, índice de refracción 1,4760 ± 0,001, pH 5, índice de acidez 15,75 ± 0,19 mg KOH/g AE, soluble en alcohol 96%. 3. El contenido de fenoles totales y flavonoides fueron de 20,85 ± 0,54 EAG/g AE y 16,26 ± 0,75 mg EQ/g AE. 4. La actividad antioxidante del aceite esencial para los siguientes ensayos fue: DPPH (10 mg/mL: 12,80 ± 0,81 %; 30 mg/mL:, 33,27 ± 2,10 % y 50 mg/mL: 60,45 ± 0,98 %); ABTS (10 mg/mL: 29,70 ± 0,44 %, 20 mg/mL: 47,77 ± 0,56 % y 30 mg/mL: 58,66 ± 0,36 %) y DPPH (30 mg/mL: 7,49 ± 0,60 mmol ET/g AE), ABTS (20 mg/mL: 12,45 ± 0,18 mmol ET/g AE ) y FRAP (20 mg/mL: 23,72 ± 0,15 mmol ET/g AE), con mejores resultados para el radical ABTS a una concentración de 30 mg/ml: 58,66 ± 0,36 %, con una IC50 de 23,29 ± 0,28 mg/mL. 46 47 VII. RECOMENDACIONES 1. Continuar con el estudio de los metabolitos secundarios presentes en la muestra de aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”, para determinar con exactitud los metabolitos responsables del aceite. 2. Continuar el estudio de la actividad antioxidante de la muestra de aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”, realizando otro método de extracción del aceite esencial. 3. Caracterizar la composición química de la hierba luisa mediante el uso de HPLC y hacer estudios más profundos sobre los compuestos fenólicos y otros antioxidantes específicos de interés poblacional. 4. Realizar la actividad antioxidante mediante métodos in vivo para confirmar el efecto antioxidante. 5. Realizar estudios comparativos de la planta con otras de la misma especie de otras zonas. 48 49 VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Miranda K, Ames H, Vergara A, Fukusaki A, Cuba K. Determinación de la actividad antioxidante de extractos de hojas de Buddleja inkana, Oreocallis grandiflora y Chuquiraga spinosa. Rev Soc Quím Perú. 2021;87(2):107-19. 2. Olarte C. Evaluación de la actividad antioxidante de extractos de Cymbopogon citratus (DC. Stapf) provenientes de matrices tratadas con radiación UV-B - 10596/19478 [Internet]. Universidad Nacional Abierta y a Distancia UNAD; 2018 [citado 2023 ene 19]. Disponible en: https://acortar.link/SiRjGA 3. Giler I, Perez T. 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𝐴𝐸 (𝑚𝐿) 𝑃𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 (𝑔) 𝑋 100 Dónde: % RAE: Porcentaje del rendimiento del aceite esencial Vol. AE: Volumen del aceite esencial obtenido en mililitros P muestra: Peso de la muestra seca en gramos Se obtuvieron los siguientes datos: Vol. A.E: 50 mL P muestra: 14 500 g %𝑅𝐴𝐸 = 50 (𝑚𝐿) 14 500 (𝑔) 𝑋 100 %𝑅𝐴𝐸 = 0,34 𝑣/𝑝 Aceite esencial obtenido (50 mL) de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa” 61 Anexo 5. Determinación de la densidad relativa del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022. 𝐷25 = 𝑀1 − 𝑀 𝑀2 − 𝑀 Dónde: M1: Peso del picnómetro + muestra (aceite esencial) (g) M2: peso del picnómetro + agua (g) M: Peso del picnómetro vacío (g) Se obtuvieron los siguientes datos: M1: 18, 2895 g M1: 18, 2863 g M1: 18, 2872 g M2: 18,8192 g M2: 18, 8194 g M2: 18, 8178 g M: 14,4365 g M: 14, 4359 g M: 14, 4357 g D25=0,879 D25=0,878 D25=0,879 𝐷25 = 18, 2895 − 14, 4365 18, 8192 − 14, 4365 𝑋𝐷25 = 0,879 ± 0,001𝑔/𝑚𝐿 62 Anexo 6. Determinación del índice de acidez del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf “hierba luisa”. Ayacucho 2022. 𝐼𝐴 = 5,61 𝑥 𝑉 𝑃 Dónde: IA: Índice de acidez P: Peso en gramos de la muestra (aceite esencial) V: Volumen en mililitro gastados de KOH Se obtuvieron tres datos: P1: 1,5174 g V: 4,2 mL P2: 1,5203 g V: 4,3 mL P3: 1,5217 g V:4,3 mL 𝐼𝐴 = 5,61 𝑥 4,2 1, 5174 𝐼𝐴1 = 15, 53 𝐼𝐴2 = 15,87 𝐼𝐴3 = 15, 85 Promedio: 15,75 ± 0,19 mg KOH/g aceite 63 Anexo